枸杞、黃芪對大鼠睪丸支持細胞功能的作用探討.pdf

1、目的：支持細胞(Sertolicell)是睪丸中一種有重要功能的細胞，除了對生精細胞起支持和營養(yǎng)作用外，Sertoli細胞還分泌雄激素結(jié)合蛋白(ABP)、抑制素(INH)、激活素(ACT)等多種因子，形成并維持有利于精子發(fā)生的微環(huán)境。越來越多的研究表明，Sertoli細胞分泌的抑制素B(INHB)是目前評價精子發(fā)生最好的內(nèi)分泌標志物。枸杞、黃芪是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，長期以來一直被祖國醫(yī)藥用作補腎益氣的藥物，具有保護睪丸功能的作用，用于

2、治療和改善男性生殖功能。枸杞與黃芪對生殖功能的影響目前有一定的報道，但僅限于組織形態(tài)學(xué)方面的研究。因此我們希望將睪丸Sertoli細胞的功能與枸杞、黃芪二者的研究聯(lián)合起來，從細胞和分子水平研究中藥對生精功能的作用，為研究男性生殖功能調(diào)控尋找一個新思路。本研究擬將大鼠睪丸Sertoli細胞進行體外分離培養(yǎng)，用免疫組織化學(xué)及RT-PCR等方法檢測Sertoli細胞分泌的與生精功能相關(guān)的激素—INH的表達情況，觀察枸杞多糖、黃芪提取液及兩藥聯(lián)

3、合使用(組成杞芪合劑)對Sertoli細胞的增殖與合成INH功能的影響，為研究生精功能的調(diào)控及其機理提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。 方法：本研究分兩部分: 1.大鼠睪丸Sertoli細胞的培養(yǎng)、鑒定與INH的表達取18-22日SD大鼠睪丸組織，采用改良的兩步酶消化法分離睪丸Sertoli細胞，將獲得的Sertoli細胞加入DMEM/F12培養(yǎng)液(含20％新生牛血清)置于37℃、5％CO2條件下進行培養(yǎng)，用MTT法描記Sertoli細

4、胞的生長曲線，利用Sertoli細胞的特異性標志物Fas-L，采用免疫組織化學(xué)方法對純化的Sertoli細胞進行鑒定，同時用免疫組織化學(xué)方法檢測Sertoli細胞中INHα亞基(INHα)、βA亞基(INHβA)、βB亞基(INHβB)的表達情況。 2.枸杞、黃芪對大鼠睪丸Sertoli細胞功能的影響本組研究分三小部分 2.1枸杞、黃芪對睪丸Sertoli細胞增殖的影響分別用枸杞、黃芪、杞芪合劑三組藥物處理體外培養(yǎng)的大鼠

5、睪丸Sertoli細胞，同時以體外正常培養(yǎng)的Sertoli細胞作為對照，用MTT法觀察上述藥物處理對睪丸Sertoli細胞增殖的影響。 2.2枸杞、黃芪對睪丸Sertoli細胞INHβB合成的影響用枸杞、黃芪、杞芪合劑三組藥物處理體外培養(yǎng)的Sertoli細胞，同時以體外正常培養(yǎng)的Sertoli細胞作為對照，用免疫組織化學(xué)方法觀察藥物處理對正常狀態(tài)及過氧化物損害狀態(tài)下Sertoli細胞INHβB合成的影響。 2.3枸杞、黃

6、芪對Sertoli細胞INHβBmRNA水平的影響用總RNA提取試劑盒提取體外培養(yǎng)的Sertoli細胞總RNA，采用一步法RT-PCR檢測INHβBmRNA片段，同時反轉(zhuǎn)錄并擴增GAPDHmRNA片段作為內(nèi)參照，觀察枸杞、黃芪、杞芪合劑三組藥物對正常狀態(tài)及過氧化物損害狀態(tài)下Sertoli細胞INHβBmRNA水平的影響，進而反映Sertoli細胞的功能狀態(tài)。 結(jié)論:本實驗在體外成功地培養(yǎng)了大鼠睪丸Sertoli細胞，通過MTT分

7、析法、免疫組織化學(xué)法與一步法RT-PCR等實驗我們發(fā)現(xiàn)： 1.經(jīng)免疫組織化學(xué)染色Sertoli細胞中INHα、INHβA、INHβB均為陽性表達，證明Sertoli細胞的確可以分泌INH，Sertoli細胞是INH的主要來源。 2.枸杞、黃芪與杞芪合劑處理體外培養(yǎng)的Sertoli細胞后，在一定程度上可以促進Sertoli細胞的增殖，而杞芪合劑與枸杞、黃芪三藥的促增殖作用相比較，并沒有明顯的差異。 3.枸杞、黃芪對