RNAi抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3中survivin基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究首先運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)，免疫印跡技術(shù)及RT-PCR技術(shù)詳盡的檢測(cè)了5個(gè)前列腺癌細(xì)胞系中survivin在蛋白水平及mRNA水平上的表達(dá)，結(jié)果顯示，各前列腺癌細(xì)胞系survivin陽(yáng)性細(xì)胞百分率，PC-3為23.4％，DU145為18.7％，LNCaP為15.2％，22RV1、PC-3M分別為11.5％和12.8％。免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性分值，PC-3為49.42±4.71，PC-3M為28.45±6.82，DU145為34.27±6.

2、08，LNCaP為34.09±5.22，22RV1為31.66±7.13。以PC-3細(xì)胞系中survivin的表達(dá)量最高(P＜0.01)。Westernblot結(jié)果顯示，PC-3、LNCaP、DU145細(xì)胞系中的survivin蛋白總量相對(duì)較高，而22RV1、PC-3M中的survivin蛋白總量相對(duì)較低，RT-PCR結(jié)果顯示，五種前列腺癌細(xì)胞系中均有survivin的表達(dá)，但以PC-3、LNCaP中的survivinmRNA水平較高。

3、研究結(jié)果表明，在研究survivin與前列腺癌的發(fā)生機(jī)制、抗藥性機(jī)制及作為新前列腺癌藥物靶位的可行性研究工作中，前列腺癌細(xì)胞系PC-3、LNCAP和DU145細(xì)胞可為首選。 隨后采用siRNA表達(dá)載體pSilencerTM3.1-H1neo構(gòu)建針了對(duì)survivin基因的siRNA表達(dá)載體，首先根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則及survivin的cDNA序列選取并設(shè)計(jì)survivin基因特異性插入序列共3對(duì)6條，將合成的DNA正義鏈及反義

4、鏈經(jīng)變性、退火，形成雙鏈DNA后再用T4DNA連接酶與pSilencerTM3.1-H1neo線性質(zhì)粒連接，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及DNA測(cè)序鑒定后，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染非雄激素依賴前列腺癌細(xì)胞系PC-3，通過RNA干涉阻斷PC-3細(xì)胞中survivin基因的表達(dá)，用RT-PCR，免疫印跡技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)survivin的表達(dá)變化，并用流式細(xì)胞技術(shù)、MTT法檢測(cè)survivin基因表達(dá)沉默后對(duì)PC-3細(xì)胞的抗凋亡能力，分化增殖能力，對(duì)化療藥

5、物的敏感性等方面的變化。DNA序列測(cè)定結(jié)果證實(shí)設(shè)計(jì)合成的DNA正確插入了載體。RT-PCR、免疫印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)表明，除pSilencer3.1-SVV1重組載體不能有效地阻斷了PC-3細(xì)胞中survivin基因的表達(dá)以外，pSilencer3.1-SVV2和pSilencer3.1-SVV3重組載體均有效地阻斷了PC-3細(xì)胞中survivin基因的表達(dá)。與對(duì)照組相比，survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)明顯下調(diào)(

6、P＜0.01)，并且轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡增加了10-15％，細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯變慢，其細(xì)胞數(shù)在84h時(shí)與對(duì)照組相比減少約30％，G1期細(xì)胞增加了10％，G2期和S期細(xì)胞減少了5％以上。在順鉑的作用下，pSilencer3.1-SVV2、pSilencer3.1-SVV3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞的細(xì)胞凋亡增加了10％至14％，存活數(shù)則下降了約35％至45％。 為了進(jìn)一步觀察RNAi介導(dǎo)的survivin基因沉默對(duì)PC-3

7、前列腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的瘤體形成能力的影響，應(yīng)用構(gòu)建的pSilencer3.1-SVV1、pSilencer3.1-SVV2、pSilencer3.1-SVV3質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒pSilencer3.1-NC轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后，將PC-3細(xì)胞接種于荷瘤裸鼠皮下，觀察轉(zhuǎn)染了各質(zhì)粒的PC-3細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的變化。結(jié)果顯示，pSilencer3.1-SVV2和pSilencer3.1-SVV3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的裸鼠腫瘤成瘤率明顯下降，裸鼠瘤

8、體生長(zhǎng)速度明顯慢于未轉(zhuǎn)染組和pSilencer3.1-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，腫瘤平均體積與瘤重與未轉(zhuǎn)染組和pSilencer3.1-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比減少50％～55％。研究結(jié)果表明，RNAi介導(dǎo)的survivin基因沉默可明顯影響PC-3細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力及瘤體生長(zhǎng)速度。 本研究初步闡明了survivin基因沉默對(duì)前列腺癌細(xì)胞的分化增殖，抗凋亡，體內(nèi)瘤體形成及對(duì)化療藥物的敏感性等方面所產(chǎn)生一系列影響，證