siRNA沉默前列腺癌細胞PC-3中A20基因的實驗研究.pdf

1、前列腺癌( Prostate Cancer )是歐美國家常見的惡性腫瘤，占男性癌癥死亡人數(shù)第二位。我國前列腺癌發(fā)病率雖遠低于歐美國家，但近年來也逐年增高，已列為男性泌尿系腫瘤的第三位。前列腺癌對人類健康的威脅變得越來越嚴重。人們在重視傳統(tǒng)的手術(shù)治療，激素治療，放、化療等治療手段的同時，也在尋找新的治療方法。 二十世紀九十年代基因治療的興起，開辟了腫瘤治療的新途徑。目前，已有多種基因治療方案得到初步應用，同時研究人員仍在不斷尋找新

2、的治療基因。A20，最初在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)，被認為是腫瘤壞死因子α( TNF-α) 可誘導的初級應答基因。隨后人們克隆了A20 基因，序列分析發(fā)現(xiàn)其編碼產(chǎn)物為一種鋅指蛋白。在人類乳腺癌MCF-7 細胞、鼠成纖維細胞瘤WEHI164 細胞、鼠胚胎成纖維NIH3T3 細胞、胰島β細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞中，A20 穩(wěn)定地高表達能夠抑制TNF 誘導的凋亡。 但是在人肝癌HepG2 細胞，肺上皮A549 細胞，人宮頸癌Hala 細胞

3、中，刺激因子刺激后A20 并未呈現(xiàn)出高表達，因而認為A20 不具有保護這些細胞的能力。一些細胞系受到A20 的保護而另一些細胞未能受到保護的原因還不清楚。目前有關(guān)A20 與腫瘤關(guān)系的研究還很少。 RNA 干擾( RNA interference，RNAi ) 指當細胞中導入與內(nèi)源性mRNA 編碼區(qū)同源的雙鏈RNA ( double stranded RNA，dsRNA )時，該mRNA 發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象

4、發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默( post transcriptional gene silencing，PTGS )。 目前，RNAi 以其特有的高效性和特異性而廣泛應用于基因功能和基因治療的科學研究中。 本研究首先通過RT-PCR ( reverse transcription-polymerase chainreaction )和Western blot 技術(shù)檢測了人前列腺癌細胞PC-3、PC-3M、DU1

5、45、Lncap 和22RV1 中A20 mRNA 和蛋白水平的表達。RT-PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，五種人前列腺癌細胞系中均有A20 的表達，其中PC-3 和PC-3M 中mRNA 和蛋白水平較高，22RV1 中較低(p<0.01)。因此，A20 在PC-3 細胞中的高表達為下一步進行的RNAi 實驗研究的細胞模型的選擇奠定了基礎。 根據(jù)A20 基因序列和siRNA 設計原則，設計并合成了三對互補的寡核苷酸

6、片斷。經(jīng)變性、退火后形成三個能表達小發(fā)夾RNA ( small hairpinRNA，ShRNA)的DNA片斷。每個DNA片斷分別與pSilencer3.1-H1 hygro載體連接，得到RNA 聚合酶Ⅲ啟動子H1 啟動的重組siRNA 表達載體pSilencer3.1-A1，pSilencer3.1-A2 和pSilencer3.1-A3，重組siRNA 表達載體經(jīng)雙酶切鑒定和DNA 序列測定后，轉(zhuǎn)染PC-3 細胞，潮霉素進行穩(wěn)定克隆

7、篩選。用RT-PCR 和Western blot 技術(shù)檢測了A20 的表達水平變化，用流式細胞儀、MTT 法檢測了A20 基因表達沉默后，PC-3 細胞的抗凋亡能力，分化、增殖能力的變化。RT-PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組和pSilencer3.1-NC 轉(zhuǎn)染的PC-3 細胞相比，重組質(zhì)粒pSilencer3.1-A1 和pSilencer3.1-A3 有效的阻斷了A20 的表達，而重組質(zhì)粒pSilencer

8、3.1-A2 轉(zhuǎn)染的PC-3 細胞中A20 表達水平?jīng)]有明顯的變化；與未轉(zhuǎn)染組和pSilencer3.1-NC 轉(zhuǎn)染的PC-3 細胞相比，pSilencer3.1-A1 和pSilencer3.1-A3 轉(zhuǎn)染的細胞的凋亡率分別增加了11.9％和7.7％，而轉(zhuǎn)染后細胞的生長速度和細胞周期沒有明顯的變化。 本研究初步證明了A20 基因在人前列腺癌PC-3 細胞中高表達且具有抗凋亡作用，為進一步證實A20 是否能成為前列腺癌基因治療的