GnT-V RNAi對人前列腺癌PC-3細(xì)胞侵襲和增殖能力的影響.pdf

1、[課題背景]
　　 前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性生殖系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率為歐美國家男性惡性腫瘤的第1位和死亡率第2位。我國PCa的發(fā)病率雖低于歐美國家,但隨著生活方式改變、人口老齡化及前列腺特異性抗原(PSA)廣泛應(yīng)用于篩查,近年來,PCa的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。國內(nèi)一項PSA篩查研究發(fā)現(xiàn),50歲以上男性的前列腺癌發(fā)病率為0.78％,提示中國的前列腺癌實際發(fā)病率并不低。因此,尋找前列腺癌有

2、效治療方法已成為一個急待解決的世界性公共衛(wèi)生問題。
　　 生物體內(nèi)的大多數(shù)蛋白質(zhì)都以糖蛋白的形式存在,糖蛋白中的糖鏈直接影響著糖蛋白生物功能的發(fā)揮。N-糖鏈的結(jié)構(gòu)改變是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟,在腫瘤細(xì)胞中,復(fù)雜糖鏈的結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變,且這種變化與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)是一個與腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的酶,研究表明GnT-V在很

3、多惡性腫瘤中增多,其產(chǎn)物GIcNAcβ1,6 Manal,6結(jié)構(gòu)有利于外鏈的延伸,已發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。
　　 基因治療是一種有前景的腫瘤治療手段,RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的一項新的基因功能研究手段,它是利用與靶基因同源的小片段雙鏈RNA(dsRNA),即siRNA,轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞,促進(jìn)靶基因mRNA降解,從而特異性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。將siRNA

4、所對應(yīng)的模板DNA雙鏈序列克隆入質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,DNA模板在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成小片段發(fā)夾狀RNA(shRNA),與化學(xué)合成的小干擾RNA(siRNA)具有相同的基因封閉作用,但作用時間可長達(dá)2個月,因其特異性和高效性成為當(dāng)前腫瘤基因治療的熱點。
　　 本實驗利用RNAi原理和技術(shù),針對前列腺癌中高表達(dá)基因GnT-V的shRNA表達(dá)質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移潛能的人前列腺癌PC-3細(xì)胞,觀察RNAi對GnT-V基因表達(dá)的抑制效應(yīng),尋找抑制效率較

5、高的RNAi片段,為尋找有效治療前列腺癌分子靶向研究中新靶點提供實驗依據(jù)。
　　 [實驗方法]
　　 1、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
　　 (1)GnT-VsiRNA序列的設(shè)計:根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中CnT-V基因已知序列(NM_002410.3)和siRNA設(shè)計原則,設(shè)計針對GnT-VcDNA的RNA片段,其序列為:GnT-V/1079 sense'GGAAGTGCATGC

6、AACTGTTTA 3’；經(jīng)Blast檢索確認(rèn)與GnT-V以外的人類已知基因序列無同源性。將其中一對的序列打亂排列,通過Blast分析無同源性超過70％的序列,作為陰性對照干擾序列,序列為:GnT-V/NC sense5'GTTCTCCGAACGTGTCACGT 3’。由上海吉瑪公司采用化學(xué)合成方法合成上述siRNA。
　　 (2)shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA的設(shè)計:根據(jù)前面設(shè)計的siRNA序列,設(shè)計模板DNA鏈,其順序分別為Bbs

7、 Ⅰ酶切位點、正義序列、9nt loop連接序列、反義序列、RNA聚合酶Ⅲ終止子(6個T)、BamH Ⅰ酶切位點。
　　 (3)質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo GnT-V的構(gòu)建及鑒定:先將各組2條模板單鏈退火處理,再與雙酶切后的pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒連接,構(gòu)建成重組體質(zhì)粒。將重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選卡那霉素抗性克隆,利用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和BamH Ⅰ雙酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒。大量擴(kuò)增搖菌后,抽提質(zhì)粒純化。

8、r>　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
　　 人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,37℃、5％C02濕度下培養(yǎng),每周傳代2～3次。PC-3細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,參照invitrogen公司Lipofectamine2000TM產(chǎn)品說明書,用脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM將質(zhì)粒導(dǎo)入PC-3細(xì)胞。
　　 3、干擾效果檢測
　　 (1)半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢

9、測GnT-V mRNA表達(dá)
　　 轉(zhuǎn)染成功后,繼續(xù)培養(yǎng)PC-3細(xì)胞48h后,收集細(xì)胞,經(jīng)Trizol一步法提取總RNA,采用AMV逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行PCR反應(yīng)。GnT-V上游引物為5’AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC3’,下游引物為5’TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT 3’,產(chǎn)物長度為555bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,40℃退火30s,72℃延伸30s,共30個循環(huán)；

10、最后72℃再延伸10min.以β-actin為內(nèi)參,上游引物為5’GAAACTACCTTCAACTCCATC 3’,下游引物為5’CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3’,產(chǎn)物長度為219 bp。以擴(kuò)增產(chǎn)物3μ1在2％瓊脂糖凝膠中電泳,攝像后使用Image.Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行光密度分析,用GnT-V/β-actin灰度比值作為GnT-V的相對表達(dá)水平。
　　 (2)蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)檢測G

11、nT-V蛋白表達(dá)
　　 轉(zhuǎn)染成功后,繼續(xù)培養(yǎng)PC-3細(xì)胞72h后,每組收集1×107個細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞裂解液提取總蛋白并進(jìn)行定量。取50μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳完成后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5％脫脂奶粉的PBST緩沖液封閉PVDF膜。然后用羊抗人GnT-V蛋白多克隆抗體(1:200)、鼠抗人GAPDH蛋白單克隆抗體(1:1000)4℃孵育過夜,洗膜后分別加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG(1:400)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1

12、:9000),室溫下?lián)u動1h,按說明書使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色,成像,底片掃描后使用Image.Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行光密度分析,用GnT-V/GAPDH代表GnT-V的相對表達(dá)水平。
　　 4、GnT-VshRNA對PC-3細(xì)胞增殖、粘附及侵襲的影響
　　 (1)CCK-8法檢測細(xì)胞增殖性
　　 取各組對數(shù)生長期的待測細(xì)胞,CCK-8法分析不同時間點(0h、24h、48h、72h、96h)的細(xì)胞活力,

13、每個時間點分別檢測8個復(fù)孔。測量兩組的OD450nm值,繪制生長曲線,并計算干擾組的生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率(IR)=(對照組OD450值-干擾組OD450值)/對照組OD450值×100％.
　　 (2)異質(zhì)粘附實驗
　　 取各組對數(shù)生長期的待測細(xì)胞,每組設(shè)24個孔。細(xì)胞用無血清RPMI1640培養(yǎng)過夜。Matrigel膠50μL/孔鋪96孔板,10g/L BSA煮沸13min變性后封閉,按5×103/孔加入細(xì)胞懸液

14、,37℃孵育1h。1×PBS沖洗3次,CCK-8法測量各組OD450nm值。
　　 (3)趨化運動實驗
　　 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用無血清RPMI1640培養(yǎng)過夜。通過24孔趨化小室檢測細(xì)胞遷移性,趨化因子為10％新生牛血清。結(jié)果表示為穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù),顯微鏡下每個復(fù)孔隨機(jī)取5個高倍鏡視野計數(shù)(400×)。
　　 (4)劃痕愈合實驗
　　 取對數(shù)生長期的待測細(xì)胞,細(xì)胞接種于包被CollagenⅣ的6

15、孔板,培養(yǎng)至細(xì)胞呈現(xiàn)出單層貼壁生長狀態(tài)。分別在各組單細(xì)胞層上劃痕,用含10％FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以使劃痕愈合。分別于劃痕后0h、12h、24h、36 h每個孔取4個視野拍照,觀察劃痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力。愈合率=[(愈合前兩側(cè)細(xì)胞層距離-愈合后兩側(cè)細(xì)胞層距離)/愈合前兩側(cè)細(xì)胞層距離]×100％.
　　 (5)細(xì)胞侵襲實驗
　　 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用無血清RPMI1640培養(yǎng)過夜。通過24孔趨化小室和matr

16、igel膠檢測細(xì)胞侵襲性.結(jié)果表示為穿過matrigel膠和聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù),顯微鏡下每個復(fù)孔隨機(jī)取5個高倍鏡視野計數(shù)(400×)。
　　 [統(tǒng)計學(xué)方法]
　　 實驗數(shù)據(jù)以(x)±s表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,兩組比較采用t檢驗,多組比較采用方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)論]
　　 1、靶向GnT-V的shRNA表達(dá)質(zhì)?？梢燥@著下調(diào)人前列腺癌PC-3細(xì)胞Gn