豬SLA--DRB1基因與PRRSV抗性的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）引起的豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種高度傳染性疾病，對世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，主要表現(xiàn)為仔豬的呼吸道疾病和妊娠母豬的繁殖障礙。PRRSV具有很強的變異性并且在豬體內(nèi)持續(xù)性感染，現(xiàn)有的疫苗無法完全控制該疾病的流行，因此遺傳抗性育種是控制該病流行的新的研究方向。已有研究表明不同豬品種之間存在PRRSV抗性的差異，姜曲海豬抗性顯著高于定遠豬，但機制不明。本文對姜曲海豬、定遠豬肺泡巨噬細

2、胞(PAM)接種PRRSV,12h后檢測基因表達，發(fā)現(xiàn)抗原遞呈過程中起重要作用的SLA-DRB1在姜曲海豬中高表達，而定遠豬中表達量甚低。在此基礎(chǔ)上，采用RNAi技術(shù)研究了SLA-DRB1基因敲減后PAMs中PRRSV載量的差異;以及SLA-DRB1上游轉(zhuǎn)錄因子CIITA和RFX5在PRRSV攻毒前后mRNA表達水平的差異;并以大白姜曲海雜交攻毒群體及其橫交一代攻毒群體為研究對象，分析了SLA-DRB1基因多態(tài)性與豬PRRSV易感性的相

3、關(guān)性，旨在探索豬對PRRSV抗性差異的潛在機制。主要試驗內(nèi)容包括以下四部分:
　　1.姜曲海豬和定遠豬PAMs中感染PRRSV前后SLA-DRB1基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平
　　本研究采用肺泡灌流的方法獲得姜曲海豬和定遠豬的肺泡巨噬細胞(PAMs)，純化后體外感染PRRSVNJGC珠，在感染PRRSV后6h和12h收集細胞，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測PRRSV-N基因、SLA-DRB1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，攻毒后，定遠

4、豬PAM中PRRSV-N基因mRNA的表達水平顯著性高于姜曲海豬(P＜0.05)，而SLA-DRB1基因mRNA表達水平均顯著低于姜曲海豬（P＜0.05），同時定遠豬PAM中SLA-DRB1基因mRNA表達水平在攻毒前亦顯著低于姜曲海豬(P＜0.05)。
　　2.SLA-DRB1基因敲減的PAM中PRRSV裁量
　　為了進一步了解SLA-DRB1基因與PRRSV之間的關(guān)系，本研究采用RNAi技術(shù)抑制了SLA-DRB1基因在P

5、AM中的表達，PRRSV感染SLA-DRB1基因表達抑制后的PAM，12h后收集細胞，熒光定量PCR技術(shù)檢測5LA-DRB1基因和PRRSV-N基因mRNA的表達水平。結(jié)果顯示SLA-DRB1基因的表達受到抑制后，接種PRRSV后12h的PAM中PRRSV-N基因的表達量顯著性上升，即PRRSV的載量顯著增加。
　　3.SLA-DRB1基因上游轉(zhuǎn)錄因子表達水平
　　為進一步探究SLA-DRB1在不同抗性豬差異表達的機制，對該

6、基因上游起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子CIITA和RFX5進行了進一步的研究。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測CIITA基因和RFX5基因在接種PRRSV后6h和12h的姜曲海豬和定遠豬PAM中的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種PRRSV后6h和12 h CIITA基因和RFX5基因在姜曲海豬中的表達水平均高于定遠豬，且在攻毒后表達水平均高于攻毒前表達水平，其表達趨勢與SLA-DRB1相同。
　　4.豬SLA-DRB1基因單核苷酸多態(tài)性與PRRSV易感性的

7、關(guān)聯(lián)分析
　　為探索豬SLA-DRB1基因單核苷酸多態(tài)性與PRRSV易感性的關(guān)系，對豬SLA-DRB1基因啟動子區(qū)和外顯子3進行擴增和測序，篩選多態(tài)性位點，分析其與PRRSV易感性的相關(guān)性。測序共發(fā)現(xiàn)了8個單堿基突變位點，分別是啟動子序列上-12bp處的C/A突變和-27 bp、-29 bp、-56 bp處的C/T突變以及在外顯子3上17 bp處的G/A突變、95 bp處的C/T突變、137 bp、232 bp處的G/C突變。針對

8、外顯子3g.232 G/C突變建立PCR-RFLP方法，在所檢測的7個群體共315個個體中該突變位點只檢測到GG型和GC型兩種基因型，在大白豬中只發(fā)現(xiàn)了GG型，大白姜曲海豬群體及橫交一代雜交群體中以GC型(0.57/0.62)居多，GG型(0.43/0.38)次之，其他群體均以GG型居多，GC型次之。對該位點大白姜曲海群體和橫交一代雜交群體不同基因型與體重及PRRSV載量進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該位點不同基因型豬血液中PRRSV載量差異不顯著

9、(P＞0.05），大白姜曲海群體中不同基因型在體重變化差異也不顯著(P＞0.05)。針對啟動子區(qū)的g.-56 C/T突變建立CRS-PCR-RFLP方法，共檢測了7個群體共315個個體，在橫交一代群體及長白豬和定遠豬中均檢測到3種基因型，均以CC型(0.43/0.62/0.46)居多，TC型(0.40/0.30/0.36)次之，TT型(0.17/0.08/0.18)最少，在大白姜曲海群體中只檢測到CC型(0.53)和TC型(0.47)兩

10、種基因型，其他群體只檢測到CC型。分析該位點與攻毒后橫交一代群體豬體重變化的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，CC型個體的平均體重極顯著性高于TT型和TC型(P＜0.01)，分析該位點與豬PRRSV易感性的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)橫交一代群體中CC基因型的PRRSV病毒載量在接毒后各時間段均不同程度的低于TT基因型和TC基因型，并于4d、7d和14d時達到顯著性差異(P＜0.05)。針對啟動子區(qū)的另外3個突變位點對橫交一代群體采用直接測序的方法進行分型，均檢測到了三種基因

11、型，-29 bp處以TC型居多，TT型次之，CC型最少;-27 bp處以TC型居多，CC型次之，TT型最少;-12 bp處以CC型最多，AC型次之，AA型最少。對-29 bp處的突變與PRRSV相對表達量及體重進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在接種病毒后7、11、14、21 d PRRSV相對表達量CC型顯著(P＜0.05)低于TT型和TC型而體重相關(guān)性分析得到CC型個體在不同時間點的平均體重最高，于接毒后14d、21 d、28 d、42 d顯著(

12、P＜0.05)高于TT型和TC型。對-27 bp處的突變與PRRSV相對表達量及體重進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在接種病毒后4d、7d、11d、14 d、21d和42dPRRSV相對表達量TT型顯著（P＜0.05）低于CC型和TC型;而體重相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TT型個體在不同時間點的平均體重最高，于接毒后21d、28d、42d顯著(P＜0.05)高于CC型和TC型，于接毒后11d、14d、35d顯著(P＜0.05）高于TC型。對-12 bp處的突變與