豬肺泡巨噬細(xì)胞M1亞型及豬KLF4基因?qū)RRSV復(fù)制影響的初步研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是最早于1987年在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)的一種新型病毒性傳染病，是現(xiàn)今世界上危害養(yǎng)豬業(yè)最重要的疾病之一。巨噬細(xì)胞是一種分布廣泛的免疫細(xì)胞，可以根據(jù)內(nèi)環(huán)境的變化從而極化為不同的類(lèi)型:經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1)，以及替代活化巨噬細(xì)胞(M2)。豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophage，PAMs)是PR

2、RSV感染后豬只體內(nèi)最重要的靶細(xì)胞。所以本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)建立PAMs體外極化模型，研究PAMs極化對(duì)PRRSV感染的影響以及PRRSV感染對(duì)PAMs影響的動(dòng)態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)采用預(yù)冷法分離PAMs，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)，分別用LPS/IFN-γ誘導(dǎo)刺激M1型巨噬細(xì)胞;用IL-4誘導(dǎo)刺激分化為M2型巨噬細(xì)胞。通過(guò)半定量PCR分別檢測(cè)M1，M2型Marker（M1:IL-1β，IL-12，IL-23和CXCL10; M2:Arg-1，IL-10，PP

3、ARγ和YM-1）表達(dá)量的變化，從核酸水平上證明極化模型的成功。同時(shí)用Western blotting從蛋白水平上確定M1型，M2型PAMs的極化成功。之后用500TCID50 HuN4-F5株P(guān)RRSV感染極化后的PAMs亞型，在感染后的12，24，36和48h分別通過(guò)間IFA和Western blotting對(duì)PRRSV的感染量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染后的12至36h內(nèi)M1型PAMs中PRRSV的感染量明顯低于正常組和M2型PAMs

4、的感染量，而在感染后的48h時(shí)M1組中PRRSV的感染量與正常組和M2型PAMs中的感染量基本一致，無(wú)顯著性的差異。
　　然而PAMs主要通過(guò)其表面的模式識(shí)別受體(pattern recognitionreceptor, PRR)發(fā)揮其天然免疫防御的功能。那么是否PRRSV感染M1型巨噬細(xì)胞對(duì)其模式識(shí)別受體產(chǎn)生了影響，從而M1型巨噬細(xì)胞對(duì)PRRSV感染在一段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生了抑制。因此我們通過(guò)熒光定量PCR的方法對(duì)感染PRRSV的M1型

5、巨噬細(xì)胞模式識(shí)別受體mRNA的表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定，并同時(shí)對(duì)被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的KLF4基因也進(jìn)行了測(cè)定。而在測(cè)定結(jié)果中我們意外的發(fā)現(xiàn)PRRSV感染極化后M1型巨噬細(xì)胞中的KLF4表達(dá)量與M1型巨噬細(xì)胞對(duì)PRRSV復(fù)制的影響趨勢(shì)相似。結(jié)果表明感染PRRSV后，隨著時(shí)間的變化M1型巨噬細(xì)胞中KLF4的表達(dá)量逐漸降低，在12h達(dá)到最低，24h后KLF4的表達(dá)量逐漸升高，且在感染后48h時(shí)KLF4的表達(dá)量與正常組的表達(dá)量基本一致，

6、無(wú)顯著性差異。
　　因此為了進(jìn)一步研究豬KLF4基因?qū)RRSV復(fù)制的影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到豬KLF4基因，通過(guò)TA克隆構(gòu)建pMD18-T-KLF4重組質(zhì)粒。酶切鑒定后將KLF4的cDNA亞克隆至pCMV-HA載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-HA-KLF4。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMV-HA-KLF4在Marc-145中，12h后感染PRRSV,并在感染后24h通過(guò)Western blotting對(duì)PRRSV的感染量進(jìn)行進(jìn)行測(cè)定。