PRRSV ADE感染對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α及IFN-β轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、豬呼吸與繁殖綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是一種以呼吸障礙、懷孕母豬繁殖障礙為特征的一種病毒性疾病,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。PRRS的致病因子為豬呼吸與繁殖綜合征病毒(Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus,PRRSV),屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科。PRRSV對(duì)巨噬細(xì)胞有專嗜性,不僅可通過天然的病毒

2、受體感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM),還可通過Fc受體介導(dǎo)的胞吞作用(ADE)感染PAM,ADE作用是PRRS防控的難題之一。
　　 PAM感染病毒后都可分泌多種細(xì)胞因子和抗病毒蛋白,其中IFN-β是機(jī)體固有免疫抵御病毒感染的重要一員,TNF-α是重要的炎性因子,并具免疫調(diào)節(jié)作用;核因子(NF-κB)是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的樞紐,調(diào)節(jié)TNF-α等多種基因的轉(zhuǎn)錄,IRF-1及IRF-3是另一類重要的轉(zhuǎn)錄因子,可與NF-κB相互作用,調(diào)控IF

3、N的表達(dá)。
　　 本研究用PRRSV BJ-4株在體外經(jīng)ADE途徑感染PAM,研究TNF-α、IFN-β、NF-κB、IRF-1及IRF-3的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài),探索PRRSV ADE感染對(duì)IFN-β及TNF-α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 采取新鮮豬肺,分離并培養(yǎng)PAM,提取PAM總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得cDNA,用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了TNF-α、IFN-β、NF-κB、IRF-1、IRF-3及β-actin基因片段,經(jīng)瓊脂糖凝膠電

4、泳檢測并回收目的PCR產(chǎn)物,與PMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR鑒定和測序,表明成功的克隆了目的基因片段。將重組質(zhì)粒依次梯度稀釋,作為標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行SYBR Green-Ⅰ熒光定量PCR擴(kuò)增,通過條件優(yōu)化,成功建立了豬細(xì)胞因子TNF-α、IFN-β及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、IRF-1、IRF-3及β-actin SYBR Green-Ⅰ熒光定量PCR檢測方法。
　　 PRRSV BJ-4經(jīng)A