miR-21inhibitor抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá).pdf

1、目的：
　　本課題以課題組前期研究為基礎(chǔ)，通過轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor下調(diào)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（NR8383）內(nèi)miR-21的水平，觀察miR-21對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide LPS）誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達(dá)的影響，探討miR-21對(duì)LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1）選用NR8383細(xì)胞作為研究對(duì)象，分別轉(zhuǎn)染10 nM、20

2、nM、40 nM濃度的FAM labeled microRNA Negative Control24小時(shí)，免疫熒光檢測miRNA的轉(zhuǎn)染效率，選取轉(zhuǎn)染效率最佳的濃度做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染濃度。
　　2）用20 nM濃度的miR-21 inhibitor和negative control分別轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞24小時(shí)，RT-qPCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-21及PTEN mRNA表達(dá)水平，western blot檢測細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白的表達(dá)水

3、平。
　　3）將體外培養(yǎng)的NR8383細(xì)胞分為兩組，分別轉(zhuǎn)染20 nM的miR-21 inhibitor和negative control24小時(shí)，然后給予終濃度為1μg/ml的LPS刺激NR8383細(xì)胞6小時(shí)，分別收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液；采用western blot檢測兩組細(xì)胞中p-AKT蛋白的表達(dá)情況；采用免疫熒光檢測兩組細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化情況；采用RT-qPCR檢測兩組細(xì)胞內(nèi)TNF-α mRNA表達(dá)水平；采用酶聯(lián)免疫吸

4、附實(shí)驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1）分別用10 nM、20 nM、40 nM濃度的FAM labeled miRNA Negative Control轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞24小時(shí)后，免疫熒光觀察轉(zhuǎn)染效率發(fā)現(xiàn)20 nM時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，大約為90％。因此選擇20nM作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染濃度。
　　2）

5、與NC轉(zhuǎn)染組比較， miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)水平下降至0.34±0.08倍（p<0.05），PTEN mRNA的表達(dá)升高2.24±0.48倍（p<0.05）， PTEN蛋白升高3.47±0.98倍（p<0.05）。
　　3）LPS刺激兩組細(xì)胞6小時(shí)后，與NC轉(zhuǎn)染組比較，miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)p-AKT蛋白的表達(dá)下降至0.19±0.11倍（p<0.05），同時(shí)NF-κB的核移

6、位明顯減少。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白的表達(dá)由（2760.50±302.80）pg/ml下降至（922.88±68.58）pg/ml，下降至0.34±0.04倍（p<0.05）；細(xì)胞內(nèi)TNF-α mRNA表達(dá)水平下降至0.34±0.78倍（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1）下調(diào)miR-21可以抑制LPS誘導(dǎo)的NR8383肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α的表達(dá)。
　　2）下調(diào)miR-21后可能通過抑制LPS誘導(dǎo)的PTEN/