肺內(nèi)調(diào)節(jié)肽對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TNF-α和TGF-β-,1-的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）作為促炎細(xì)胞因子刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，后者又進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞釋放炎性因子，形成惡性循環(huán)，是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵部分。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-beta，TGF-β1）可通過(guò)誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞增生、成纖維細(xì)胞表型改變、膠原纖維及細(xì)胞外基質(zhì)合成增加等多種機(jī)制參與肺的重塑。肺泡巨噬細(xì)胞源性TNF-α、TGF-

2、β1與急性肺損傷、肺纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptides，VIP）和降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是肺內(nèi)重要的調(diào)節(jié)肽，對(duì)肺內(nèi)多種細(xì)胞具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。VIP具有抑制肺泡巨噬細(xì)胞吞噬和T淋巴細(xì)胞增殖、減少肺炎性介質(zhì)釋放、促進(jìn)氣道上皮的損傷修復(fù)、清除氧自由基和抗細(xì)胞凋亡等生物學(xué)作用；而CGRP可調(diào)節(jié)肺泡巨噬細(xì)胞及外

3、周巨噬細(xì)胞MMPs/TIMPs、IL-1等多種炎癥因子的分泌。因此，肺內(nèi)調(diào)節(jié)肽（VIP、CGRP）可能對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α和TGF-β1的分泌和表達(dá)產(chǎn)生影響。 目的：觀察肺內(nèi)調(diào)節(jié)肽（VIP，CGRP）對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α與TGF-β1表達(dá)和分泌的影響，并初步探討其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 方法：（1）VIP對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α、TGF-β1表達(dá)和分泌的影響：以巨噬細(xì)胞（R

4、AW264.7細(xì)胞株）為研究對(duì)象，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)VIP對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-α、TGF-β1的影響；ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、TGF-β1含量及VIP的作用；采用RT-PCR法檢測(cè)巨噬細(xì)胞TNF-α和TGF-β1mRNA的表達(dá)，并觀察PKC阻斷劑H-7、PKA阻斷劑H-89、CaM阻斷劑W-7和MAPK阻斷劑PD98059對(duì)上述作用的影響；（2）CGRP對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α、TGF-

5、β1表達(dá)的影響：采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)CGRP對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-α、TGF-β1的影響；RT-PCR法檢測(cè)CGRP對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α和TGF-β1mRNA表達(dá)的作用，并觀察H-7、H-89、W-7和PD98059對(duì)CGRP作用的影響。 結(jié)果： 1.VIP對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α、TGF-β1表達(dá)和分泌的影響。 （1）免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：LPS誘導(dǎo)6h巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色的T

6、GF-β1、TNF-α顆粒增加；VIP預(yù)處理組巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒明顯少于LPS組。 （2）ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：LPS誘導(dǎo)6h巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β1、TNF-α明顯增加（P<0.01），VIP預(yù)處理組可抑制該上調(diào)作用（p<0.05）。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，VIP對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α的作用可被PKC和PKA阻斷劑阻斷；而VIP對(duì)巨噬細(xì)胞TGF-β1.的作用可被PKA和CaM阻斷劑阻斷（P<0.05）。 （3）RT-P

7、CR檢測(cè)結(jié)果顯示： LPS時(shí)間依賴(lài)性（2h、4h、6h、12h、24h）上調(diào)巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá)，VIP可逆轉(zhuǎn)該上調(diào)作用，并呈劑量相關(guān)性（10-10mol/L-10-6 mol/L）。VIP（10-8 mol/L）下調(diào)LPS誘導(dǎo)6h巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA的效應(yīng)可被H-7、H-89所阻斷（P<0.05）。 LPS時(shí)間依賴(lài)性（2h、4h、6h、12h、24h）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TGF-β1 mRNA的表達(dá)上

8、調(diào)，且在6h就達(dá)到峰值（P<0.05）。VIP（10-8 mol/L）在2h、4h可上調(diào)TGF-β1 mRNA的表達(dá)，而在6h、12h、24h可減少TGF-β1 mRNA的表達(dá)（P<0.05）。 VIP呈劑量依賴(lài)性（10-10 mol/L-10-6 mol/L）下調(diào)LPS誘導(dǎo)6h巨噬細(xì)胞TGF-β1 mRNA的表達(dá)。VIP（10-8mol/L）對(duì)LPS誘導(dǎo)6h巨噬細(xì)胞TGF-β1 mRNA的下調(diào)效應(yīng)可被H-89、W-7所阻斷（P<0.0

9、5），提示VIP該作用與PKA，CaM途徑有關(guān)。 2.CGRP對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、TGF-β1表達(dá)的影響。 （1）免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：LPS誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色的TGF-β1、TNF-α顆粒增加；CGRP預(yù)處理組巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒明顯多于LPS組。 （2）RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示： LPS誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá)明顯增加，CGRP預(yù)處理呈劑量（10-10m

10、ol/L-10-6 mol/L）及時(shí)間（2h、4h、6h、12h、24h）依賴(lài)性增強(qiáng)該上調(diào)作用，CGRP（10-8 mol/L）增加LPS誘導(dǎo)6h巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)的效應(yīng)可被H-89、W-7及PD98059所阻斷（P<0.05），提示CGRP增加LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與PKA、CaM及MAPK有關(guān)。 CGRP預(yù)處理呈劑量（10-10mol/L-10-6mol/L）及時(shí)間（2h、

11、4h、6h、12h）依賴(lài)性增強(qiáng)巨噬細(xì)胞TGF-β1 mRNA的表達(dá)，該效應(yīng)可被H-7、H-89、W-7所阻斷（P<0.05），提示CGRP上述作用的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與PKC、PKA、CaM有關(guān)。 結(jié)論： 1.LPS能促進(jìn)巨噬細(xì)胞TNF-α、TGF-β1的分泌和表達(dá)。 2.VIP可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌和表達(dá)，其胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與PKC、PKA有關(guān)。 3.VIP早期促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞