FcγR Ⅰ在PRRSV-ADE作用中的研究及LPS對PRRSV感染的影響.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的一種豬的病毒性傳染病。本試驗(yàn)通過研究IgG單體在PRRSV侵染PAM細(xì)胞的過程中的作用，為探討FcγRⅠ在PRRSV感染中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。PRRSV感染后往往引起副豬嗜血桿菌等革蘭氏陰性細(xì)菌繼發(fā)感染，本試驗(yàn)初步研究了LPS對PRRSV感染的影響，為更加深入的探討PRRSV與細(xì)菌混合感染的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究從健康豬肺收集PAM細(xì)胞，提

2、取總RNA，設(shè)計(jì)一對FcγRⅠ胞外區(qū)(除去信號(hào)肽)的特異性引物FY。用RT-PCR方法擴(kuò)增出其基因片段，大小約為822bp，將這基因片段亞克隆到pET-32a載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-FY。在WIG的誘導(dǎo)下成功表達(dá)，獲得了分子量大小約為422KD的重組蛋白FY，與預(yù)期的蛋白分子量相符；通過優(yōu)化表達(dá)條件，大量表達(dá)重組蛋白，用尿素法對表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化與復(fù)性。用純化蛋白免疫小鼠，制備抗重組蛋白FY的多克隆抗體，經(jīng)間接ELISA檢測，效

3、價(jià)為1:12800，并做免疫印跡試驗(yàn)，結(jié)果顯示制備的多抗可以與各自的重組蛋白特異性結(jié)合，表明表達(dá)的重組蛋白具有較好的免疫原性。
　　 本研究用純化的兔IgG(3.0mg/mL)經(jīng)皮下免疫豬，每頭2.2mL，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測血清中抗兔IgG抗體效價(jià)，待抗體效價(jià)達(dá)到1:32時(shí)鼻腔接種PRRSV，接種后4d、6d、9d、13d、17d、20d、23d、26d、39d、47d、51d分別采集血液樣品制備血清，用熒光定量RT-PCR方法

4、檢測PRRSV病毒核酸，并用ELISA方法檢測抗PRRSV抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，免疫感染組豬感染后4-39天均可在血清中檢測到PRRSV核酸，而接毒對照組則只在4-26d天檢測到病毒核酸，免疫感染組病毒血癥比感染對照組持續(xù)時(shí)間延長8天，且免疫感染組在4d、6d、9d、13d、17d、23d、26d、39d時(shí)PRRSVmRNA水平均較接毒對照組略微升高。免疫組血清ELISA抗體檢測在9d、13d、17d、23d均為PRRSV抗體陽性，陽性抗

5、體在體內(nèi)維持15天；接毒對照組血清ELISA抗體檢測在6d、9d、13d、17d均為陽性，陽性抗體在體內(nèi)維持12天；其中在13d和17d時(shí)免疫組血清抗體效價(jià)較接毒對照組稍高，以上結(jié)果說明豬體內(nèi)PRRSV非特異性IgG能促進(jìn)病毒感染。本研究通過先將終濃度為1.30mg/mL的PRRSV陰性健康豬IgG于37℃處理PAM細(xì)胞12h后，再將100個(gè)TCID50的PRRSV病毒液0.2mL接種PAM細(xì)胞，并設(shè)接毒對照組，通過熒光定量RT-PCR

6、方法分別測定感染后12h、24h、36h、48hPRRSV拷貝數(shù)變化，結(jié)果顯示，PRRSV陰性健康豬IgG處理組PRRSV在各時(shí)間段拷貝數(shù)均較接毒對照組顯著提高，其中12h最高，拷貝數(shù)是對照組的11.7倍，48h最低，是對照組的3.5倍，說明PRRSV非特異性豬IgG經(jīng)FcγRⅠ促進(jìn)PRRSV在PAM細(xì)胞中的復(fù)制。
　　 本試驗(yàn)通過將鼠抗豬FcγRⅠ胞外區(qū)重組蛋白多抗加入PAM細(xì)胞作用1h后接種PRRSV，分別培養(yǎng)12h、24h

7、、36h、48h后，收集細(xì)胞及上清，同時(shí)鼠陰性血清加入PAM細(xì)胞作用1h后接種PRRSV作為對照，用real-timePCR方法檢測PAM細(xì)胞中病毒拷貝數(shù)，結(jié)果顯示，各時(shí)間段鼠抗豬FcγRⅠ胞外區(qū)重組蛋白多抗處理試驗(yàn)組PRRSV拷貝數(shù)與陰性血清處理組相比各時(shí)間段均增高，其中24h最高升高6.3倍。本研究通過將鼠抗豬FcγRⅠ胞外區(qū)重組蛋白多抗加入PAM細(xì)胞作用1h后分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h，收集細(xì)胞及上清，同時(shí)做鼠陰性血清

8、處理組和健康細(xì)胞對照組，用real-timePCR方法檢測PAM細(xì)胞中IFN-α、TNF-α、IL-10mRNA水平。結(jié)果顯示，特異性抗體處理試驗(yàn)組與陰性血清處理對照組相比12h、24h、36h、48hIFN-αmRNA水平均升高，其中12h最多升高3.9倍；特異性抗體處理試驗(yàn)組與陰性血清對照組相比，TNF-αmRNA水平各時(shí)間段均升高，其中12h、24h顯著升高；特異性抗體處理試驗(yàn)組與陰性血清處理對照組相比，IL-10mRNA轉(zhuǎn)錄水平

9、各時(shí)間段均顯著降低。以上試驗(yàn)說明PAM細(xì)胞內(nèi)激活FcγRⅠ能夠促進(jìn)IFN-α、TNF-αmRNA的轉(zhuǎn)錄，而抑制IL-10mRNA轉(zhuǎn)錄，由此推測PRRSV感染前期通過FcγRⅠ介導(dǎo)的PAM細(xì)胞吞噬作用促進(jìn)病毒增殖，后期抗病毒因子發(fā)揮抑制病毒增殖作用。本試驗(yàn)為深入研究FcγRⅠ在PAM細(xì)胞抗病毒免疫中所起的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 將PRRSV病毒接于培養(yǎng)PAM細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，200μL/孔，12h后加入終濃度100ng/m

10、LLPS的RPMI1640營養(yǎng)液(V+L組)；將終濃度100ng/mL的LPSRPMI1640營養(yǎng)液接于培養(yǎng)PAM細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)12h，每孔加病毒液200μL(L+V組)，設(shè)病毒感染對照組(V組)，均以加入病毒液時(shí)開始計(jì)時(shí)同時(shí)設(shè)LPS誘導(dǎo)對照組(LPS組)。培養(yǎng)12h、24h、36h、48h收集細(xì)胞及上清，同時(shí)設(shè)健康細(xì)胞對照組。用real-timePCR方法檢測PAM細(xì)胞中的PRRSV拷貝數(shù)和IFN-α、IL-10mRNA

11、轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，V+L組與V組相比，各時(shí)間段PRRSV拷貝數(shù)均顯著降低；L+V組PRRSV拷貝數(shù)各時(shí)間段均比V組顯著降低；LPS組IFN-αmRNA水平與健康細(xì)胞對照組相比，48h顯著提高，其余時(shí)間段相差不大；LPS組IL-10mRNA水平與健康細(xì)胞對照組相比各時(shí)間段差異均不顯著；由此得出LPS能夠顯著抑制PRRSV在PAM細(xì)胞中的增殖，LPS輕微促進(jìn)健康PAM細(xì)胞IFN-αmRNA的轉(zhuǎn)錄，而對健康PAM細(xì)胞IL-10mRNA的轉(zhuǎn)錄

12、調(diào)節(jié)作用不明顯。V組IFN-αmRNA水平與健康細(xì)胞對照組相比，各時(shí)間段均降低，且36h和48h顯著降低，V組IL-10mRNA水平與健康細(xì)胞對照組相比各時(shí)間段均顯著升高；V+L組IFN-αmRNA水平與V組相比在24h、36h、48h均顯著升高，其中48h時(shí)最高達(dá)11倍，且整體呈上升趨勢，V+L組IL-10mRNA水平與V組相比在24h、36h、48h均顯著降低，且整體呈下降趨勢；L+V組各時(shí)間段IFN-αmRNA水平與V組相比均顯著