豬CD151免疫血清的制備及其對PRRSV感染的阻斷作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合癥(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，目前我國主要用疫苗接種預(yù)防，但預(yù)防效果不理想。據(jù)報道，豬CD151能與PRRSV3’非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，CD151抗血清處理MARC-145細(xì)胞可完全阻斷PRRSV感染，但用此抗血清處理豬巨噬細(xì)胞能否阻斷PRRSV感染尚不清楚。為了回答這一問題，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)發(fā)表的序列設(shè)計引物，用RT-

2、PCR從豬肺巨噬細(xì)胞細(xì)胞中擴(kuò)增CD151胞外區(qū)編碼序列，序列測定結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物與發(fā)表序列的核苷酸同源性為99.7％，氨基酸序列同源性為99.2％。將豬CD151胞外區(qū)編碼序列與羊細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)胞外區(qū)(IgV)編碼序列融合，構(gòu)建融合表達(dá)載體pET-IgV-CD151。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組大腸桿菌表達(dá)預(yù)期的30kDa融合蛋白

3、。用包涵體分離法獲得純化的重組蛋白。以50μg蛋白/只的劑量3次免疫小鼠后，間接ELISA抗體效價可達(dá)1:150000。以制備的免疫血清進(jìn)行Western bloting試驗(yàn)，結(jié)果在CD151+PAM中能檢測到預(yù)期的29kDa蛋白條帶，在CD151-PK-15細(xì)胞中未能檢測到同樣的蛋白條帶。先用不同稀釋倍數(shù)的免疫血清處理MARC-145，然后用PRRSV感染，感染后定期觀察細(xì)胞病變和進(jìn)行組織細(xì)胞半數(shù)感染劑量(TCID50)測定，結(jié)果在接

4、種后的72小時內(nèi)，免疫血清處理能阻斷PRRSV對MARC-145細(xì)胞的感染，阻斷作用具有血清劑量依賴性和毒株差異性，完全阻斷2株P(guān)RRSV感染的免疫血清稀釋倍數(shù)分別1:20和1:40；再用不同稀釋倍數(shù)的免疫血清與PRRSV孵育，然后接種PAM或MARC-145細(xì)胞，定期進(jìn)行細(xì)胞病變觀察和TCID50測定，結(jié)果在接種后的72小時內(nèi)，免疫血清處理也能阻斷PRRSV對MARC-145細(xì)胞的感染，完全阻斷2株P(guān)RRSV感染的免疫血清稀釋倍數(shù)分別