CEA580-598短肽的基因克隆、表達(dá)及兔免疫血清的制備.pdf

1、目的： 1.預(yù)測癌胚抗原（CEA）的CTL、B細(xì)胞表位，為CEA表位疫苗設(shè)計(jì)及其單克隆抗體制備等研究提供理論依據(jù)。 2.通過對(duì)CEA的CTL、B細(xì)胞表位預(yù)測分析，選擇含多個(gè)CTL、B細(xì)胞表位的短肽（CEA580-598）基因，構(gòu)建CEA580-598多表位的原核重組質(zhì)粒pET32a（+）/CEA580-598，用帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽（His.tag）的PET32a（+）原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CEA580-598表位肽融合蛋白，并

2、通過Ni-NTA樹脂親和層析法純化獲得表位融合蛋白，命名為ozlf-75/76。 3.將純化的表位融合蛋白o(hù)zlf-75/76免疫日本大耳白兔，制備高效價(jià)特異性兔免疫血清抗體，為建立CEA免疫檢測的方法打下了基礎(chǔ)。 方法： 1.根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)CEA B表位預(yù)測的結(jié)果[1]，篩選CEA B表位，另通過在線軟件SYFPEITHI法進(jìn)行HLA-A2，HLA-A24和H2-Kd限制性的CTL表位的預(yù)測，選擇含多個(gè)CTL表

3、位肽和B表位肽的CEA580-598短肽作為目的基因。 2.按原核系統(tǒng)偏愛的氨基酸密碼子進(jìn)行目的基因的密碼子優(yōu)化，委托生物技術(shù)公司合成寡核苷酸，退火獲得目的基因，并將目的基因克隆至原核表達(dá)載體pET32a（+）多克隆位點(diǎn)內(nèi)。構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒（pET32a（+）/CEA580-598），將此重組載體轉(zhuǎn)化E.coli菌株BL21（DE3表達(dá)融合蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE、Western Blot分析鑒定。用Ni-NTA樹脂親和層

4、析法分別純化表位融合蛋白o(hù)zlf-75/76。 3.用純化表位融合蛋白o(hù)zlf-75/76與佐劑混勻后，分別于0w、2w、4w背部多點(diǎn)免疫日本大耳白兔，共3次，于第5周對(duì)日本大耳白兔進(jìn)行心臟采血，收獲兔免疫后血清制備多克隆抗體，用Western blot方法進(jìn)行特異性鑒定分析，ELISA法檢測抗體水平以分析其免疫原性，進(jìn)一步檢測兔免疫血清與LOVO細(xì)胞抗原（CEA抗原）結(jié)合的抗體水平。 4.使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的分析。 結(jié)果： 1、目的基因篩選：選擇CEA589-598（NRSDPVTLDVLYGPDTPⅡ）短肽，CEA580-584為預(yù)測的B細(xì)胞表位，CEA589-597為HLA-A2表位，CEA590-598既為H2-Kd限制性表位又為HLA-A24限制性表位。 2、多表位目的基因的原核重組質(zhì)粒pET32a（+）/CEA580-598，經(jīng)酶切和測序鑒定，構(gòu)建成功。經(jīng)SDS-PAGE分析表明，重

6、組質(zhì)粒在37℃條件下經(jīng)1.0mM IPTG誘導(dǎo)6h能很好地表達(dá)目的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）約為21 kDa，與預(yù)期Mr大小吻合；并經(jīng)Western blot鑒定為目的蛋白，即ozlf-75/76。用Ni-NTA樹脂親和層析法成功純化表位融合蛋白o(hù)zlf-75/76。 3、所有日本大白耳兔在全程免疫后都產(chǎn)生了高效價(jià)的血清抗體，最高滴度達(dá)1：3200。Western blot檢測結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）約為21 kDa處出

7、現(xiàn)單一條帶。獲得了高效價(jià)的CEA580-598短肽日本大耳白兔免疫血清，兔免疫血清CEA抗原特異性抗體ELISA讀數(shù)水平均值為0.39±0.10，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)組抗體水平與PBS和pET32a（+）對(duì)照組比較具有顯著性差異（P=0.017）。 結(jié)論： 1、預(yù)測并篩選了富含CTL表位和B細(xì)胞表位的CEA580-598多表位肽，為腫瘤疫苗的設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2、通過分子克隆成功構(gòu)建了