兔抗ES細(xì)胞免疫血清對(duì)附植前小鼠胚胎的作用.pdf

1、目前,四倍體胚胎補(bǔ)償技術(shù)(Tbtraploid Embryos Complementation)被廣泛的應(yīng)用到小鼠克隆之中。但是,與同一時(shí)期的二倍體胚胎相比,四倍體胚胎的細(xì)胞數(shù)目要少一半,而且發(fā)育能力要弱。因而,我們希望制作一種沒(méi)有ICM(內(nèi)細(xì)胞團(tuán))的二倍體胚胎來(lái)提高這種補(bǔ)償技術(shù)的效率。
　　 小鼠胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem cells,ES細(xì)胞)是從附植前內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass,ICM)經(jīng)體外抑

2、制分化培養(yǎng)而分離。收集大量的小鼠ES細(xì)胞,并將其與佐劑乳化,注射到兔子體內(nèi),收集抗血清培養(yǎng)小鼠附植前胚胎。有可能會(huì)抑制ICM的生長(zhǎng)。
　　 用KSOM小鼠胚胎培養(yǎng)基稀釋兔抗血清,分別稀釋至50倍、100倍、200倍,結(jié)果顯示:形態(tài)學(xué)上50倍稀釋的血清能夠抑制8cell胚胎的發(fā)育甚至使其死亡;100倍稀釋的抗血清能夠延遲8cell胚胎的致密化,并使得胚胎在囊胚化過(guò)程中出現(xiàn)空泡化的現(xiàn)象;200倍稀釋的抗血清作用不明顯。未作免疫處理的

3、兔血清與空白對(duì)照組無(wú)差異。試驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn):兔抗小鼠ES細(xì)胞血清能夠阻止小鼠胚胎卵裂期的致密化,培養(yǎng)8h發(fā)現(xiàn)胚胎致密化效率降低70％;將致密化的胚胎置于抗血清中培養(yǎng),胚胎會(huì)發(fā)生去致密化;延長(zhǎng)的去致密化胚胎超過(guò)32cell后,進(jìn)一步在抗血清中培養(yǎng),囊胚的畸形率增加。
　　 在抗血清中持續(xù)培養(yǎng)之后,胚胎在囊胚化的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)兩種類(lèi)型的胚胎:
　　 (1)空泡化,胚胎內(nèi)部沒(méi)有清晰的囊胚腔,也不包含明顯的ICM,而是出現(xiàn)數(shù)個(gè)流

4、動(dòng)性的液泡;
　　 (2)真囊胚,這類(lèi)胚胎表現(xiàn)出正常的形態(tài)特征。
　　 將這兩種類(lèi)型的囊胚移植到2.5dpc的假孕母鼠體內(nèi),10天后處死,統(tǒng)計(jì)附植情況發(fā)現(xiàn)空泡化胚胎和形態(tài)正常的胚胎附植率與對(duì)照組相比都表現(xiàn)差異極顯著(p＜0.01),但空泡化的附植率與形態(tài)正常胚胎附植率相比差異不顯著(p＞0.05)。但即使是附植成功的胚胎,在第十天之前許多胎兒明顯已經(jīng)退化了,只留有未吸收完的組織團(tuán)塊,這些組織團(tuán)塊類(lèi)似于早期的胎盤(pán)。

5、　　 在8cell胚胎培養(yǎng)到60h后,對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組胚胎進(jìn)行Hochest33342染色,計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)顯示,抗血清處理組細(xì)胞數(shù)顯著下降(p＜0.01)。
　　 胚胎接種試驗(yàn)結(jié)果顯示,抗血清處理后的胚胎Outgrowth的生長(zhǎng)率顯著低于對(duì)照組,且Outgrowth的形態(tài)表現(xiàn)得更分散、立體性不強(qiáng)、面積較小、邊緣不夠整齊。血清處理組中有極少的一部分胚胎接種后只有滋養(yǎng)層細(xì)胞長(zhǎng)出,而沒(méi)有ICM。
　　 對(duì)Outgrowth的堿性