PRRSV與HPS共感染作用及HPS毒力基因.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPS)是一種豬上呼吸道的常在菌,能夠從健康豬的鼻、氣管和扁桃體中分離得到,在正常情況下不呈現(xiàn)臨床癥狀,但在特定條件下可侵入機體,從而引起豬多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎、腦膜炎等疾病。近幾年,隨著我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化的發(fā)展,該病以繼發(fā)的方式存在于各規(guī)?；i場,并呈逐年上升趨勢,增加了斷奶到保育階段仔豬的發(fā)病率及死亡率,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失,已成為嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的重要細菌性疾病

2、之一。
　　近年來,對HPS的致病機理與毒力因子的研究更加受到國內(nèi)外學者的重視,但這些毒力因子是否與HPS的毒力密切相關,還需要進一步研究。明確HPS的致病機理及毒力因子對HPS的預防與治療具有重要意義。
　　為了深入了解HPS的血清型流行情況及該病與其他病原體的混合感染情況,從我國部分地區(qū)送檢的186份新鮮樣品中共分離鑒定得到57株HPS分離株,分離率為30.6％,其中血清4型和5型是該菌流行的優(yōu)勢血清型,HPS與PRRS

3、V混合感染所占比例最高。研究還發(fā)現(xiàn)該病春、秋、冬季的發(fā)病率要高于夏季,且多發(fā)于4~7周齡的保育豬。對16SrRNA的PCR產(chǎn)物進行測序及序列比對結果發(fā)現(xiàn)許多菌株在243-244位為CT,在256-258位為AAG,在417-421位為ACATA,這為HPS疫苗菌株血清型的篩選及該病的防治提供了重要的參考依據(jù)。
　　為了進一步明確PRRSV與HPS的相互作用,選取32頭4周齡健康仔豬進行攻毒試驗,結果發(fā)現(xiàn)共感染組和HPS組仔豬體溫明

4、顯高于PRRSV組和對照組(P<0.05),而且共感染組在攻HPS后的1~3d體溫明顯高于HPS組(P<0.05)。HPS組比共感染組有更嚴重的纖維素性心包炎、腹膜炎癥狀。熒光定量PCR檢測各個臟器細菌含量,發(fā)現(xiàn)心臟和肺臟含菌量明顯高于其它組織,且心臟含菌量最高;共感染組含菌量明顯高于HPS組,陰性對照組無變化。試驗結果說明, PRRSV能加快感染HPS豬只的死亡速度,對HPS有一定程度的協(xié)同增殖作用。
　　選取不同血清型的HPS

5、分離株對仔豬和BALB/c小鼠進行攻毒試驗,比較該菌對兩種動物的致病性。結果表明,相同血清型的HPS分離株對仔豬和BALB/c小鼠的毒力一致,這為研究HPS分離株的毒力奠定了基礎。
　　采用抑制消減雜交的方法,使LC株(血清1型)與ZQ株(血清4型)中共有的基因片段得到有效的差減,而僅存在與LC株中的特異性表達基因得到特異性擴增。利用克隆技術,成功構建HPS差減文庫,再通過斑點雜交技術,得到差異片段,送測序后,經(jīng)同源序列分析獲得的

6、差異片段,主要以編碼限制性修飾系統(tǒng)、外膜蛋白、代謝相關蛋白、調(diào)節(jié)與轉運相關蛋白、DNA合成相關蛋白、噬菌體相關蛋白為主,還有許多未知功能蛋白。通過PCR結合小鼠攻毒試驗,分析差異基因與HPS分離株的毒力的關系,進一步確定了4個基因(hsdR,hsdS, gpT和ompP2)是HPS的毒力基因。試驗還發(fā)現(xiàn)HPS同一血清型的不同分離株的毒力存在相當大差異,而且菌株的分離部位與毒力也存在一定的關系。本研究為進一步探究HPS強毒力菌株和弱毒力菌

7、株之間的差異以及毒力基因的功能研究奠定了重要基礎。
　　選擇HPS的毒力基因ompP2和gpT,克隆至真核表達載體,成功構建重組質(zhì)粒pCI-neo-ompP2和pCI-neo-gpT,轉染Marc-145細胞,觀察24h、36h和48h細胞形態(tài)的變化,兩種質(zhì)粒轉染后,均能引起細胞死亡,通過Western-blot方法鑒定不同時間段蛋白的表達量,發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加蛋白的表達量也逐漸增加,這初步確定ompP2基因和gpT基因與HPS毒

8、力有關,為下一步構建HPS缺失株提供了參考依據(jù)。
　　利用同源重組技術成功構建HPS LC株的缺失株LCΔompP2株,并對野生型菌株和缺失株的生長特性和毒力進行了研究,結果證實ompP2基因的敲除對菌株的生長造成了一定的影響,而且ompP2缺失株對仔豬的毒力明顯減弱,說明ompP2的確是HPS的毒力基因。本研究通過構建HPS缺失株LCΔompP2,為深入探討ompP2基因的功能,特別是野生型菌株與缺失株LCΔompP2在粘附方面