豬GBP1、GBP2基因的克隆及其對(duì)PRRSV和PRV增殖的影響.pdf

1、干擾素誘導(dǎo)的GBPs又稱p65 GTPase，屬于干擾素誘導(dǎo)的GTPase超家族，是一種重要的干擾素刺激基因(ISGs)。GBPs最早發(fā)現(xiàn)于1979年，Gupta發(fā)現(xiàn)經(jīng)IFN-γ刺激后，人的成纖維細(xì)胞可以產(chǎn)生一種67kDa的蛋白。GBP蛋白與Mx蛋白同屬GTPase家族。自1979年被發(fā)現(xiàn)以后，后續(xù)的研究中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)干擾素誘導(dǎo)的GBPs家族在調(diào)控細(xì)胞增殖和抵抗病原體感染方面具有重要作用。目前對(duì)干擾素誘導(dǎo)的GBPs家族的研究主要集中在人和小

2、鼠上，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了干擾素誘導(dǎo)的GBPs家族具有抵抗病毒感染的作用，但具體機(jī)制尚不明晰。目前對(duì)豬源GBPs生物學(xué)功能的研究并不多，僅有豬源GBPs可以顯著抑制鼠傷寒沙門氏桿菌增殖的報(bào)道，豬源GBPs是否有抑制病毒增殖的作用目前尚無報(bào)道。PRRSV和PRV引發(fā)的疾病給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究以豬源干擾素誘導(dǎo)的鳥苷酸結(jié)合蛋白家族中GBP1和GBP2兩個(gè)成員為研究對(duì)象，研究豬GBPs對(duì)PRRSV和PRV增殖的影響，以及PRRSV和P

3、RV感染對(duì)GBPs表達(dá)的影響，主要研究內(nèi)容如下:
　　1.豬GBP1和GBP2基因的擴(kuò)增和序列分析
　　從PK-15細(xì)胞中克隆了豬GBP1和GBP2基因的cDNA序列，其大小分別為1773bp和1776bp，這與GenBank上所報(bào)道的豬GBP1和GBP2序列基本一致，同源性分別為99.44％和99.5％。序列分析發(fā)現(xiàn):豬GBP1和GBP2核苷酸和氨基酸的同源性分別為77.31％和69.20％。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明:不同物種間

4、GBP1和GBP2的同源性很高，其中豬與人的GBP1和GBP2同源性最高，這說明干擾素誘導(dǎo)的GBPs家族在進(jìn)化上比較保守。
　　2.豬GBP1和GBP2蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
　　通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)豬GBP1和GBP2具有干擾素誘導(dǎo)的GBPs家族的典型結(jié)構(gòu)即N端可以結(jié)合GTP的球狀結(jié)構(gòu)域、C端α螺旋以及中問連接區(qū)域。
　　3.豬GBP1和GBP2蛋白的真核表達(dá)及亞細(xì)胞定位
　　構(gòu)建了豬GBP1和GBP2的真核表達(dá)重組

5、質(zhì)粒pCAGGS-HA-GBP1和pCAGGS-HA-GBP2，轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)?？梢哉_表達(dá)重組蛋白，其表達(dá)蛋白大小約為67kDa;轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞后通過間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬GBP1和GBP2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。
　　4.豬GBP1和GBP2蛋白對(duì)PRRSV和PRV增殖的影響
　　使用豬GBP1和GBP2的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-

6、GBP1和pCAGGS-HA-GBP2分別轉(zhuǎn)染PAM和Marc-145細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后24h接種PRRSVWUH3株(MOI=0.5)，接毒后24h收毒。通過相對(duì)熒光定量檢測(cè)PRRSV基因組復(fù)制情況，通過病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRRSV的增殖情況，結(jié)果證實(shí)豬GBP1和GBP2可以顯著抑制PRRSV的增殖。使用不同劑量的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-GBP1和pCAGGS-HA-GBP2轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后24h接種PRR

7、SVWUH3株(MOI=0.5)，接毒后24h收毒，通過病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRRSV的增殖情況，結(jié)果表明豬GBP1和GBP2對(duì)PRRSV增殖的影響具有劑量依賴性。
　　使用豬GBP1和GBP2真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-GBP1和pCAGGS-HA-GBP2轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后24h接種PRVEa株(MOI=1)，接毒后18h收毒，通過相對(duì)熒光定量和病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRV的增殖情況，結(jié)果證實(shí)豬GBP1和GBP2可以

8、顯著抑制PRV的增殖。使用不同劑量的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-GBP1，和pCAGGS-HA-GBP2轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后24h接種PRVEa株(MOI=1)，接毒后24h收毒，通過病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRV的增殖情況，結(jié)果顯示豬GBP1和GBP2對(duì)PRV增殖的影響具有劑量依賴性。
　　5.PRRSV和PRV感染對(duì)豬GBP1和GBP2的影響
　　使用豬GBP1和GBP2真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-HA-GB

9、P1和pCAGGS-HA-GBP2分別轉(zhuǎn)染Marc-145和PK-15細(xì)胞，分別接種PRRSV和PRV后通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)和DAPI核染色，在熒光顯微鏡下觀察，接毒組和對(duì)照組中豬GBP1和GBP2均定位于細(xì)胞質(zhì)，這說明PRRSV或PRV感染均不能改變豬GBP1和GBP2的亞細(xì)胞定位。
　　以PRRSV感染PAM細(xì)胞，PRV感染PK-15細(xì)胞，通過相對(duì)熒光定量檢測(cè)豬GBP1和GBP2mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):PRV感染