3135.三角帆蚌免疫相關(guān)基因hsp70、tnfaip8、gbp1及tlr2的克隆與表達(dá)分析

1、分類(lèi)號(hào)：密級(jí)：學(xué)校代碼：10414學(xué)號(hào)：2013010794碩士研究生學(xué)位論文三角帆蚌免疫相關(guān)基因三角帆蚌免疫相關(guān)基因HSP70、TNFAIP8、GBP1及TLR2的克隆與表達(dá)分析的克隆與表達(dá)分析CloningexpressionanalysisofimmunerelatedgenesHSP70、TNFAIP8、GBP1TLR2fromHyriopsiscumingii吳圣楠吳圣楠院所：生命科學(xué)學(xué)院導(dǎo)師姓名：劉毅副教授學(xué)科專(zhuān)業(yè)：生物化學(xué)

2、與分子生物學(xué)研究方向：分子免疫學(xué)二○一六年五月I摘要三角帆蚌（Hyriopsiscumingii）是我國(guó)特有的淡水良種育珠貝，易受病害威脅而遭受重大經(jīng)濟(jì)損失，開(kāi)展三角帆蚌免疫相關(guān)基因研究具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究采用RACE技術(shù)，對(duì)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所獲得的三角帆蚌（Hyriopsiscumingii）熱休克蛋白70（HSP70）、腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8（TNFAIP8）、干擾素誘導(dǎo)的鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白1（GBP1）與Toll樣受體2（

3、TLR2）基因的長(zhǎng)片段進(jìn)行擴(kuò)增，拼接得到這四種免疫相關(guān)基因的cDNA序列全長(zhǎng)，采用熒光定量PCR（qRTPCR）技術(shù)研究了HcHSP70和HcTNFAIP8基因在各組織中的表達(dá)分布情況及其應(yīng)激表達(dá)情況，并采用Westernblot技術(shù)從蛋白質(zhì)水平研究溫度刺激對(duì)HcHSP70表達(dá)的影響。HcHSP70基因cDNA序列全長(zhǎng)2298bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?974bp，編碼657個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量大小為71.6kDa。含有三個(gè)HSP70家族典

4、型的標(biāo)簽序列，末端保守區(qū)域EEVD以及典型的重復(fù)位點(diǎn)GGXP。與其他物種HSP70同源性很高，最高達(dá)91%，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)HcHSP70與其它4種軟體動(dòng)物HSP70聚為一支。HcHSP70在肝胰腺中表達(dá)量最高，其次是性腺，而在鰓、外套膜及肌肉中的表達(dá)量較低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)顯示，鰓組織中HcHSP70mRNA和蛋白的表達(dá)量隨水溫上升而上調(diào)，37℃時(shí)表達(dá)量顯著上升到最高值，而40℃時(shí)表達(dá)量恢復(fù)至正常水

5、平。HcTNFAIP8基因cDNA序列全長(zhǎng)1179bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?73bp，編碼190個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量大小為23.64kDa。HcTNFAIP8與長(zhǎng)牡蠣CgTNFAIP8相似性最高為71%，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的同一個(gè)分支上。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：HcTNFAIP8在性腺中表達(dá)量最高，其次為肝胰腺，而在鰓、外套膜及心臟中表達(dá)量較低；HcTNFAIP8的表達(dá)并不受PGN的誘導(dǎo)影響，而在LPS刺激后，HcTNFAIP8表達(dá)量出現(xiàn)先顯

6、著下調(diào)再上調(diào)情況，最終恢復(fù)接近到正常值。HcGBP1基因cDNA全長(zhǎng)為2418bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?947bp，編碼648個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量大小為76.28kDa。同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)HcGBP1與非洲爪蟾GBP1處于同一個(gè)大分支中；HcTLR2基因cDNA序列全長(zhǎng)1177bp開(kāi)放閱讀框?yàn)?032bp，編碼343個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量大小為39.58kDa，同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)三角帆蚌與馬氏珠母貝聚為一支。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：三角帆蚌；熱休克蛋白