三角帆蚌鈣代謝相關(guān)基因的全長cDNA克隆與表達分析.pdf

1、珍珠是貝類進行鈣代謝的主要產(chǎn)物，其中95％以上的成份是CaCO3晶體。三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我國特有的優(yōu)良淡水育珠蚌，其生長速度快、育珠質(zhì)量好。本試驗以三角帆蚌外套膜為研究材料，采用同源克隆策略和RACE技術(shù)，成功克隆得到鈣網(wǎng)蛋白基因(calreticulin，CRT)、肌球蛋白必需輕鏈基因(myosin essential light chain，MELC)的全長cDNA序列，并對其核苷酸序列和氨基酸序列結(jié)

2、構(gòu)進行分析，然后對上述兩個基因在不同組織和不同Ca2+濃度處理下外套膜中的表達情況進行了研究，探討了CRT基因、MELC基因與Ca2+吸收、轉(zhuǎn)運與貯存等關(guān)系，并推測其參與三角帆蚌鈣代謝的過程，試驗結(jié)果如下:
　　 采用同源克隆策略和RACE技術(shù)，從三角帆蚌外套膜組織中成功克隆得到CRT基因和MELC基因的全長cDNA序列:(1) CRT基因全長1838 bp，其中開放閱讀框為1257bp，編碼418個氨基酸，相對分子量為49.1

3、0 ku，理論等電點為4.46，5'端非編碼區(qū)為75bp，3'端非編碼區(qū)為506 bp，GenBank登錄號為JX416227;(2) MELC基因全長1119bp，開放閱讀框為468bp，編碼155個氨基酸，相對分子量為17.49ku，理論等電點為4.53，5'端非編碼區(qū)為46bp，3'端非編碼區(qū)為605bp，GenBank登錄號為JX275828。
　　 生物信息學(xué)分析表明:(1)三角帆蚌CRT基因具有一段信號肽序列、兩條典

4、型的鈣網(wǎng)蛋白家族標(biāo)簽序列KHEQNIDCGGGY和IMFGPDICG、三個保守的N-、P-和C-端功能域及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前導(dǎo)序列HDEL; NJ法系統(tǒng)進化分析顯示三角帆蚌首先與海洋雙殼類緊密聚在一起，且與蚯蚓等環(huán)節(jié)動物親緣關(guān)系較近，聚為一支;(2)通過PROSITE tools軟件預(yù)測顯示三角帆蚌MELC基因有一對保守的EF-hand結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合Ca2+，屬于EF-hand鈣結(jié)合蛋白家族;同源性比對分析顯示，三角帆蚌MELC基因與合浦珠母貝、

5、太平洋牡蠣、盤鮑等海水貝類的MELC基因同源性最高，依次為69％、69％、68％; NJ法系統(tǒng)進化樹表明三角帆蚌首先與軟體動物聚在一起，且與環(huán)節(jié)動物和線形動物等親緣關(guān)系較近，聚為一支。
　　 經(jīng)實時熒光定量PCR檢測，CRT基因和MELC基因在三角帆蚌的外套膜、閉殼肌、斧足、鰓、肝臟、性腺、心臟、腸等8個組織中均表達，說明其參與三角帆蚌多種生理功能的調(diào)節(jié)，但表達量有顯著差異，其中在外套膜、鰓和斧足等與貝類鈣代謝相關(guān)的組織中表達量

6、遠高于心臟和腸等組織，預(yù)示CRT基因和MELC基因可能參與三角帆蚌的鈣代謝過程。同時，不同Ca2+濃度處理試驗結(jié)果表明，隨著水體中Ca2+濃度逐漸升高，三角帆蚌CRT基因和MELC基因在外套膜中的表達量均呈先上升后下降的趨勢，且都在60 mg/L時達到最高值，表明適宜的Ca+濃度可以刺激CRT基因和MELC基因大量表達，而過高的Ca+濃度則會抑制CRT基因和MELC基因的表達。上述試驗結(jié)果表明，CRT基因和MELC基因與Ca2+吸收、轉(zhuǎn)