枯草芽孢桿菌突變株的構(gòu)建及其對豬肺泡巨噬細胞(MΦ3D4-2)免疫因子表達的影響.pdf

1、益生菌主要通過細胞免疫和體液免疫途徑改善動物機體的免疫功能，促進動物健康生長?？莶菅挎邨U菌是一種可飼用益生菌，對增強機體免疫能力，活化免疫系統(tǒng)具有重要的作用。目前，關(guān)于可飼用型枯草芽孢桿菌調(diào)節(jié)機體免疫機制研究較少。因此，本試驗旨在研究枯草芽孢桿菌(Bacillus.subtilis)不萌發(fā)芽孢和不生孢營養(yǎng)體對豬肺泡巨噬細胞(MΦ3D4/2)免疫功能的影響。從B.subtilis PY79基因組DNA中分別擴增clW、gerD和spo0A

2、上下游同源臂，以pshuttleF質(zhì)粒為模板，擴增抗性基因spec，分別構(gòu)建用于敲除B.subtilis PY79芽孢萌發(fā)基因clW、gerD、clW-gerD和生孢早期基因spo0A的重組整合載體pLTJ-9、pLTJ-12、pYGJ-6和pYGJ-8;分別將整合載體轉(zhuǎn)入B.subtilis PY79化學感受態(tài)細胞，利用同源重組敲除B.subtilis PY79芽孢萌發(fā)基因clW、gerD、clW-ger和生孢早期基因spo0A，篩選

3、芽孢不萌發(fā)突變株B.subtilis clW-、B.subtilis gerD-、B.subtilis clW-ger-和不生孢突變株B.subtilis spo0A-，提取基因組DNA進行PCR檢測;結(jié)合革蘭氏染色和萌發(fā)率檢測，分別對構(gòu)建的B.subtilis芽孢不萌發(fā)突變株和不生孢突變株進行萌發(fā)和生孢能力鑒定;以PBS和B.subtilis PY79為對照組，B.subtilis clW-gerD-和B.subtilis spo0A

4、-作為試驗組，分別與豬肺泡巨噬細胞于37℃，5％CO2共培養(yǎng)12h后，收集培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測IL-1β，TNF-αt、IL-10等免疫相關(guān)細胞因子表達水平。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.PCR檢測結(jié)果表明，成功敲除了B.subtilis PY79萌發(fā)相關(guān)基因clW、gerD和clW-gerD及生孢早期基因spo0A，獲得不萌發(fā)突變株B.subtilis clW-、B.subtilis gerD-、B.subtil

5、is clW-gerD-和不生孢突變株B.subtilis spo0A-;
　　2.萌發(fā)和生孢能力檢測結(jié)果顯示，3株不萌發(fā)突變株中B.subtilis clW-gerD-完全喪失芽孢萌發(fā)能力，B.subtilis clW-和B.subtilis gerD-仍具有一定程度的萌發(fā)能力;顯微鏡觀察和生孢率檢測表明不生孢突變株B.subtilis spo0A-喪失了生孢能力;
　　3.與MΦ3D4/2共培養(yǎng)結(jié)果表明，B.subtil