枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法的建立和Pglv高效表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，雖然它的載體、受體系統(tǒng)已經(jīng)比較成熟完善，但其表達(dá)產(chǎn)物容易形成包涵體，分泌效率低，此外大腸桿菌是一種潛在病原菌，生長(zhǎng)過(guò)程中不斷釋放脂多糖熱原物質(zhì)等內(nèi)毒素，目前已被限制用于表達(dá)生產(chǎn)醫(yī)藥和食品。
　　枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為表達(dá)系統(tǒng)具有無(wú)致病性，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，嚴(yán)格生長(zhǎng)在有氧條件下，容易將表達(dá)蛋白分泌到培養(yǎng)基中。此外芽孢桿菌的發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)非常成熟，如α-淀粉酶、蛋白酶等商品化的酶都是利用枯草

2、芽孢桿菌生產(chǎn)的。
　　本實(shí)驗(yàn)著重構(gòu)建可調(diào)控的枯草芽孢桿菌高效表達(dá)載體。從篩選強(qiáng)麥芽糖啟動(dòng)子出發(fā)，并成功構(gòu)建了麥芽糖誘導(dǎo)型表達(dá)載體Pglv-pHCMC04，并通過(guò)轉(zhuǎn)化方法比較、優(yōu)化得出最適轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的方法:低鹽環(huán)境饑餓法，即S法，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1.2×104 CFU/μgDNA;后為了研究所構(gòu)建的表達(dá)載體特性，本實(shí)驗(yàn)從大小基因及信號(hào)肽方面著手，通過(guò)連接紅色熒光蛋白、帶有地衣芽孢桿菌信號(hào)肽的高溫淀粉酶基因、去掉信號(hào)肽的地衣芽孢桿菌

3、高溫淀粉酶基因、帶有灰色鏈霉菌信號(hào)肽的淀粉酶基因等一系列報(bào)告基因?qū)ζ涮匦匝芯康贸?小基因在枯草中表達(dá)的可能性及大基因在枯草中表達(dá)需要帶信號(hào)肽，且枯草在分泌胞外蛋白時(shí)對(duì)不同屬的信號(hào)肽具有識(shí)別作用。然后對(duì)連接有地衣芽孢桿菌信號(hào)肽的高溫淀粉酶基因進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，從最適麥芽糖添加量、最適誘導(dǎo)溫度、最適誘導(dǎo)物添加時(shí)間、和最適接種量幾方面著手，進(jìn)行單因素發(fā)酵條件優(yōu)化，得出了最適的發(fā)酵條件，即:將過(guò)夜培養(yǎng)菌株接種2％至OD600達(dá)到0.55時(shí)添加1