黑龍江立克次體感染早期Tim-3的免疫學(xué)作用研究.pdf

1、立克次體是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏染色呈陰性的致病微生物，立克次體感染能夠引起立克次體病。立克次體病主要有：斑點(diǎn)熱、恙蟲病、斑疹傷寒等等。立克次體病是一類呈世界性分布的、嚴(yán)重威脅人類健康的人獸共患的自然疫源性疾病。其中斑點(diǎn)熱是由斑點(diǎn)熱群立克次體感染引起。主要的斑點(diǎn)熱包括立氏立克次體（R. rickettsii）引起的落磯山斑點(diǎn)熱（Rocky Mountain Spotted Fever， RMSF）、康氏立克次體（R. conorii）引

2、起的地中海斑點(diǎn)熱（Mediterranean Spotted Fever，MSF）、澳大利亞立克次體（R. australis）引起的昆士蘭斑點(diǎn)熱（Queensland Spotted Fever，QSF）、小蛛立克次體（R. akari）引起的立克次體痘（Rickettsial Pox）等。斑點(diǎn)熱的潛伏期為4~7天，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉痛和皮疹等癥狀。其中立氏立克次體引起的落磯山斑點(diǎn)熱臨床癥狀最為嚴(yán)重，如果得不到及時(shí)治療，感染者

3、大多會(huì)因?yàn)槟I功能衰竭而死亡。斑點(diǎn)熱在我國(guó)廣泛存在，主要有由西伯利亞立克次體（R. sibirica）引起的北亞熱（North Asian Tick-borne Rickettsiosis）和由黑龍江立克次體（R. heilongjiangensis）引起的遠(yuǎn)東斑點(diǎn)熱（Far East Spotted Fever）。黑龍江立克次體引起的遠(yuǎn)東斑點(diǎn)熱是東北亞洲地區(qū)的一種新發(fā)傳染病。感染者可有發(fā)熱、寒顫、頭痛、肌肉痛、關(guān)節(jié)痛、厭食、以及黃斑或斑

4、丘疹等癥狀，合并有肝腫大和谷丙轉(zhuǎn)氨酶和/或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性升高等肝臟損傷表現(xiàn)。用黑龍江立克次體感染小鼠，小鼠會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的全身感染癥狀，并伴隨有肺、肝、脾、腦組織損傷。
　　最初T細(xì)胞免疫球蛋白和粘附分子-3(Tim-3)被認(rèn)為是Th1細(xì)胞的特異性受體，它通過(guò)調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的功能，維持免疫平衡和免疫耐受。大量的研究表明， Tim-3也表達(dá)于天然免疫細(xì)胞，包括：?jiǎn)魏?巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）和自然殺傷細(xì)胞（NK）等，并且Ti

5、m-3通過(guò)選擇性的活化天然免疫細(xì)胞促進(jìn)免疫平衡。另外，有研究發(fā)現(xiàn)Tim-3也表達(dá)于人類血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）。近些年， Tim-3在抗感染免疫方面的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。Tim-3信號(hào)通路可以在病毒、胞外菌、胞內(nèi)菌的感染中，發(fā)揮抗感染的免疫調(diào)節(jié)作用。但是， Ti m-3在專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌——立克次體感染中的免疫學(xué)作用還不清楚。
　　血管內(nèi)皮細(xì)胞是立克次體感染最主要的靶細(xì)胞。入侵宿主后，立克次體主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖。在立克

6、次體感染過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活并釋放大量細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在抗感染免疫中發(fā)揮重要的作用。本課題從動(dòng)物水平、細(xì)胞水平和分子水平三個(gè)層面研究探討：Tim-3是否參與立克次體感染早期過(guò)程；Tim-3是增強(qiáng)或抑制機(jī)體抗立克次體免疫應(yīng)答；其作用機(jī)制是什么？
　　首先，我們經(jīng)腹腔注射法用黑龍江立克次體感染小鼠，再分別用 qPCR法和 RT-PCR方法檢測(cè)感染1~3天內(nèi)小鼠脾臟的立克次體載量變化和 Tim-3 mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果

7、發(fā)現(xiàn)立克次體感染3天內(nèi)，小鼠脾臟立克次體數(shù)量隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，Tim-3 mRNA表達(dá)水平則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。用黑龍江立克次體感染體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞系（Ea.hy926），結(jié)果顯示感染后3天內(nèi)，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)立克次體數(shù)量逐漸增多，內(nèi)皮細(xì)胞的Tim-3 mRNA表達(dá)水平則逐漸下降。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，因此 Tim-3參與了立克次體感染早期機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程。
　　Tim-3參與了立克次體感染早期的免疫應(yīng)答，那么它在該過(guò)

8、程中發(fā)揮怎樣的免疫調(diào)節(jié)作用呢？我們假設(shè)Tim-3能夠促進(jìn)機(jī)體或者血管內(nèi)皮細(xì)胞清除/殺傷細(xì)胞內(nèi)立克次體。為了證明這一假說(shuō)，我們使用小鼠Tim-3胞外段與人IgG1-Fc融合蛋白（mTim-3-Ig）阻斷小鼠的Tim-3信號(hào)通路，并用人IgG1-Fc蛋白（Ig）作為同型對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tim-3信號(hào)通路阻斷后，小鼠脾臟的立克次體數(shù)量明顯增多，同時(shí)小鼠外周血中細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-18）和趨化因子RANTES表達(dá)水

9、平明顯降低。這一結(jié)果提示，Tim-3信號(hào)通路的阻斷能夠抑制宿主/宿主細(xì)胞的抗胞內(nèi)寄生菌相關(guān)的免疫因素，進(jìn)而促進(jìn)立克次體感染。另外，用黑龍江立克次體感染Tim-3高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠（Tim-3-Tg），我們發(fā)現(xiàn)立克次體感染后第3天，Tim-3-Tg小鼠無(wú)明顯感染癥狀，而野生型對(duì)照小鼠感染癥狀則非常明顯。并且，Tim-3-Tg小鼠外周血的抗胞內(nèi)菌感染相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子水平顯著高于野生型小鼠。該結(jié)果進(jìn)一步證明，增加 Tim-3表達(dá)能夠增強(qiáng)

10、宿主抗立克次體免疫應(yīng)答。
　　黑龍江立克次體感染重組人Tim-3-人IgG1-Fc融合蛋白（hTim-3-Ig）預(yù)處理的人血管內(nèi)皮細(xì)胞（Ea.hy926），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染3天后該細(xì)胞內(nèi)立克次體數(shù)量顯著多于對(duì)照組細(xì)胞。這一結(jié)果說(shuō)明，Tim-3信號(hào)激活后能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞殺傷胞內(nèi)立克次體。用黑龍江立克次體感染穩(wěn)定高表達(dá)或低表達(dá) Tim-3的Ea.hy926細(xì)胞，立克次體感染3天后的結(jié)果顯示，Tim-3高表達(dá)細(xì)胞的立克次體數(shù)量顯著低于

11、對(duì)照細(xì)胞，而 Tim-3低表達(dá)細(xì)胞的立克次體數(shù)量顯著高于對(duì)照細(xì)胞。綜上所述，增加 Tim-3表達(dá)能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞殺傷胞內(nèi)立克次體的作用，而阻斷Tim-3信號(hào)或者抑制Tim-3表達(dá)會(huì)抑制相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胞內(nèi)立克次體的增加。Tim-3在立克次體感染的過(guò)程中具有增強(qiáng)機(jī)體的抗感染免疫反應(yīng)。
　　NO在殺傷胞內(nèi)菌方面發(fā)揮重要作用。我們用細(xì)胞因子（RANTES、TNF-α、IFN-γ和IL-1β）雞尾酒方法刺激人臍帶靜

12、脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），并用黑龍江立克次體感染該細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞因子雞尾酒處理的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO顯著增加，同時(shí)胞內(nèi)立克次體拷貝數(shù)減少，而受 iNOS抑制劑 NGMMLA作用的內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生減少，且細(xì)胞內(nèi)的立克次體數(shù)量增加。該研究明確證明，血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠通過(guò)增加NO的合成去殺傷胞內(nèi)立克次體。
　　Tim-3能否通過(guò)增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO抑制立克次體感染？我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)論是阻斷Tim-3信號(hào)通路還是降低T

13、im-3表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，感染立克次體后，細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)水平明顯降低，并且IFN-γmRNA表達(dá)水平也同樣降低。這些數(shù)據(jù)提示，Tim-3信號(hào)通路的激活能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的iNOS表達(dá)，并通過(guò)增加 NO的合成去殺傷細(xì)胞內(nèi)的立克次體。我們還發(fā)現(xiàn)，Tim-3-Tg小鼠感染3天后，脾臟細(xì)胞iNOS、IFN-γ和TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著高于野生型小鼠，而脾臟立克次體數(shù)量則顯著低于野生小鼠。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明，Tim-3信號(hào)