乙肝疫苗評(píng)價(jià)技術(shù)及其應(yīng)用研究.pdf

1、通常MHC Ⅰ類四聚體被用于定量分析表位特異的CDS<'+>T細(xì)胞。MHC Ⅰ類四聚體是由4個(gè)MHC Ⅰ類復(fù)合物和一個(gè)帶有熒光標(biāo)的親和素分子構(gòu)成的。其中每個(gè)MHC Ⅰ類復(fù)合物是由分別表達(dá)、純化的MHC分子的重鏈和β 2微球蛋白與表位肽在折疊緩沖液中共折疊所形成的。這種方法勢(shì)必會(huì)形成較多的多聚物和自身折疊產(chǎn)物，而且同時(shí)純化兩種單體是很費(fèi)時(shí)的。為了解決這些問題，在本研究中，我們將串聯(lián)設(shè)計(jì)的人/鼠嵌合MHC分子的重鏈(HLA-A2 α1，HL

2、A-A2 α2，MHC-H2D α3)與β2微球蛋白克隆到pET17b載體上，并表達(dá)為融合蛋白。將融合蛋白與HLA-A2限制性表位肽兩者共折疊形成人/鼠嵌合MHC Ⅰ類復(fù)合物。這樣就會(huì)提高四聚體的得率，同時(shí)也可以節(jié)省大量時(shí)間。此外，我們還采用了凝膠遲滯的方法來(lái)檢測(cè)人/鼠嵌合MHC Ⅰ類復(fù)合物生物素化的效率。我們將最終形成的人/鼠嵌合四聚體用于體外定量檢測(cè)HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠上所產(chǎn)生的HLA-A2限制性細(xì)胞免疫水平。 由于缺少合適

3、的動(dòng)物模型，在體內(nèi)對(duì)人乙肝疫苗免疫原性的臨床前評(píng)價(jià)一直受到了制約。在本研究中，我們構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)HBV和HLA兩種基因的HBV/HLA-A2.1雙轉(zhuǎn)基因鼠。此雙轉(zhuǎn)基因鼠不僅表現(xiàn)出對(duì)HBV各種抗原的耐受，而且能夠有效地遞呈HLA-A2限制性抗原表位。我們用HLA-A2限制性HBc或HBs的表位疫苗免疫此雙轉(zhuǎn)基因鼠，借助CTL實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)和四聚體染色等手段證明此雙轉(zhuǎn)基因鼠能夠被有效的誘導(dǎo)出針對(duì)HLA-A2限制性HBe和HBs特異性

4、的免疫應(yīng)答。 總之，我們構(gòu)建的有生物活性的人/鼠嵌合四聚體以及HBV/HLA-A2.1雙轉(zhuǎn)基因鼠國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。人.鼠嵌合四聚體能恰當(dāng)?shù)亩糠从矵LA-A2限制性細(xì)胞免疫水平。同時(shí)，HBV/HLA-A2.1雙轉(zhuǎn)基因小鼠能夠從多方面評(píng)價(jià)人乙肝疫苗的免疫原性：抗體的產(chǎn)生、γ干擾素的分泌水平、免疫小鼠的特異性CTL活性和有效降低體內(nèi)抗原水平。這些結(jié)果也進(jìn)一步證明了HBV/HLA-A2.1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為評(píng)價(jià)人乙肝病毒疫苗免疫原性動(dòng)物