BIOMED-2系統(tǒng)IgH引物的篩選驗(yàn)證及相關(guān)基因重排研究.pdf

1、一、研究背景和目的 淋巴瘤病理診斷是臨床病理診斷的難題之一，2001年世界衛(wèi)生組織(WHO)定義惡性淋巴瘤中每一個獨(dú)立疾病(或類型)需要結(jié)合形態(tài)學(xué)、免疫表型、遺傳學(xué)和臨床特點(diǎn)來確定，特別強(qiáng)調(diào)基因重排檢測技術(shù)輔助診斷淋巴瘤的重要性。大部分可疑的高度反應(yīng)增生性淋巴組織，可以通過組織形態(tài)學(xué)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)合免疫組化或流式細(xì)胞技術(shù)檢測免疫表型來與惡性淋巴瘤甄別。但還有大約5～15％的病例難以確診。原則上，惡性淋巴瘤的瘤細(xì)胞都來自一個共同的

2、克隆，所以能夠依靠克隆性鑒定來進(jìn)行輔助診斷。 淋巴細(xì)胞惡性腫瘤以B細(xì)胞來源為主，約占90％，免疫球蛋白重鏈基因(IgH)分析方法主要有DNA印跡法(Southemblot)、PCR、測序等。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的方法以其簡便、高效、廉價(jià)及適用面廣而在淋巴瘤基因重排研究方面越來越受重視。但不同研究文獻(xiàn)中所采用的引物、PCR條件、PCR產(chǎn)物檢測方法等都不盡相同，結(jié)果也有差異。難以找到適于常規(guī)臨床病理診斷的標(biāo)準(zhǔn)程序，影響了PCR技術(shù)的應(yīng)

3、用價(jià)值。 2003年歐洲七國47個研究所的病理學(xué)家、分子生物學(xué)家及其它研究人員經(jīng)過四年半的研究發(fā)表了標(biāo)準(zhǔn)化引物系統(tǒng)(BIOMED-2)，建立了用于克隆性分析的基因重排及染色體易位檢測的PCR方法學(xué)和引物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)化，可檢測出幾乎所有克隆性T、B細(xì)胞克隆細(xì)胞群乃至高度體細(xì)胞突變B細(xì)胞淋巴瘤/白血病，實(shí)現(xiàn)了前所未有高檢出率。BIOMED-2引物系統(tǒng)是劃時代的，其設(shè)計(jì)思想十分先進(jìn)，將該技術(shù)進(jìn)一步完善并及早運(yùn)用于臨床已勢在必行，但該系統(tǒng)

4、過于龐大復(fù)雜，目前在國內(nèi)難以推廣應(yīng)用，更不利于臨床診斷的使用。本研究以淋巴瘤細(xì)胞系、石蠟組織及外周血淋巴細(xì)胞為主要研究對象，從BIOMED-2系統(tǒng)IgH引物分析篩選、PCR檢測的條件進(jìn)行了優(yōu)化、引物效果的驗(yàn)證、外周血淋巴細(xì)胞DNA的提取及IgH基因重排的檢測等諸方面進(jìn)行了探索，以期獲得一套便于國人用于臨床檢測淋巴組織增生性疾病IgH基因重排的小型多重引物系統(tǒng)。 二、方法 1.BIOMED-2引物的篩選①運(yùn)用Clustal

5、W軟件對IgH基因重排檢測的20條BIOMED-2引物與基因組中相應(yīng)區(qū)域家族基因片段進(jìn)行比較和分析，了解IgH各家族基因片段的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和引物的匹配率之間的關(guān)系；②用PrimerPremier5.0、Oligo6軟件對引物自身結(jié)構(gòu)和上、下游引物之間的關(guān)系進(jìn)行了分析；③用Blast程序?qū)σ飳癎enbank核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析。此外，通過文獻(xiàn)分析了解各家族基因參與重排的情況，綜合各種分析數(shù)據(jù)篩選出小型引物方案MINI系統(tǒng)。

6、 2.BIOMED-2引物的條件進(jìn)行優(yōu)化和選擇通過檢測5種淋巴瘤細(xì)胞株細(xì)胞的IgH基因重排，了解其基因重排的類型和特點(diǎn)。將BIOMED-2IgH引物的條件進(jìn)行優(yōu)化和選擇，使用瓊脂糖電泳和單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)以及T-A克隆測序分析PCR產(chǎn)物。并以T-A克隆方法構(gòu)建FR1-JH陽性質(zhì)粒。 3.DNA提取效果的比較用30例健康成人外周血標(biāo)本，通過測定DNA含量和觀察PCR結(jié)果等方法，比較了酚抽提法、消化法和兩種試劑盒法對外周

7、血淋巴細(xì)胞DNA提取效果。四種提取方法濃度和純度之間的差異性使用SPSS軟件(SPSS13.0forWindows)進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析(采用One-wayANOVA檢驗(yàn))，以P＜0.01作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 4.BIOMED-2引物篩選后的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證使用BIOMED-2系統(tǒng)IgH引物和MINITWO引物系統(tǒng)以及VH-JH引物對60例B淋巴瘤石蠟組織進(jìn)行了檢測，使用spss13.0軟件進(jìn)行X2檢驗(yàn)做率與率之間的比較，以P

8、＜0.01作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 5.對200例不同病種(淋巴細(xì)胞造血系統(tǒng)疾病61例，健康人群及非淋巴造血系統(tǒng)疾病139例)外周血淋巴細(xì)胞的基因重排進(jìn)行檢測，了解外周血淋巴細(xì)胞IgH基因重排的情況，探索其對淋巴瘤診斷的意義。 三、結(jié)果 1.通過分析BIOMED-2三管IgH引物，篩選出兩套多重引物MINIONE及MINITWO，分別針對新鮮組織/外周血/骨髓三者及石蠟包埋組織提取的DNA。 2.使用BIOM

9、ED-2系統(tǒng)IgH引物檢測淋巴瘤細(xì)胞株，其中四種B淋巴瘤細(xì)胞株基因重排得到清晰的條帶。DG75可擴(kuò)增出2條等亮度清晰條帶，經(jīng)測序證實(shí)存在完整的IgHVDJ雙重排，其中一條為無功能的重排。 3.以T-A克隆的方法構(gòu)建了檢測VDJ重排的5個陽性質(zhì)粒，適用于BIOMED-2FR1/FR2/FR3-JH引物管及普通通用引物。 4.①電泳結(jié)果及濃度測定表明，消化法提取的DNA產(chǎn)量最高，完整性最好；②OD260/OD280比值表明，

10、酚抽提法和試劑盒法提取的DNA質(zhì)量要優(yōu)于消化法，PCR擴(kuò)增看家B-globin基因片段的結(jié)果表明無明顯差異。 5.在60例B細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織中，MINITWO系統(tǒng)的IgH基因重排檢出率達(dá)到95％，與BIOMED-2IgH引物FR2、FR3引物管檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MINITWO系統(tǒng)檢出率高于普通VH-JH引物，有顯著性差異。 6.MINIONE系統(tǒng)對200例健康人群及多病種外周血淋巴細(xì)胞IgH重排檢測，淋巴細(xì)胞增殖

11、性疾病中，克隆性增殖的陽性率達(dá)到59.02％，非淋巴細(xì)胞增殖性疾病中克隆性增殖的陽性率達(dá)到1.44％。 四、結(jié)論 本研究分析BIOMED-2系統(tǒng)IgH引物及IgH基因結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，篩選出兩組多重引物組合。通過對淋巴瘤細(xì)胞株、B淋巴瘤石蠟組織及淋巴造血系統(tǒng)疾病、非淋巴造血系統(tǒng)疾病外周血淋巴細(xì)胞基因重排的檢測，得出如下有意義的結(jié)論： 1.BIOMED-2引物有效地解決了普通通用引物覆蓋率低的問題，本文篩選得到的小型多重

12、引物組合MINIONE及MINITWO取得較高的檢出率，而引物數(shù)目較少，操作簡單，更為經(jīng)濟(jì)實(shí)用，更適合于國內(nèi)臨床診斷使用。 2.BIOMED-2系統(tǒng)為分析克隆演變提供了簡便的方法。 3.BIOMED-2及MINI系統(tǒng)的反應(yīng)體系和程序需要結(jié)合儀器設(shè)備及試劑優(yōu)化PCR條件。 4.DG75細(xì)胞等位基因上存在完整的IgHVDJ雙重排，其中VH假基因參與了重排。 淋巴造血系統(tǒng)疾病外周血中檢測到59.02％的克隆性I