水合氯醛保護(hù)LPS-D-GalN誘發(fā)小鼠致死性肝損傷和zymosan誘發(fā)腹膜炎及其機(jī)理研究.pdf

1、急性尤其是致死性感染或非感染性炎癥是臨床與基礎(chǔ)研究的重要課題,也是新藥研發(fā)的重要目標(biāo)。人們?cè)诨瘜W(xué)藥物、植物提取物,包括中草藥中不懈地尋找新的先導(dǎo)化合物,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一些已經(jīng)被批準(zhǔn)的,或長期用于臨床其他方面的藥物具良好的抗炎活性。
　　 在本研究中,我們采用了兩個(gè)經(jīng)典的動(dòng)物模型,即脂多糖/D-氨基半乳糖(LPS/D-GalN)誘發(fā)的急性致死性肝損傷和酵母多糖誘發(fā)的急性非致死性腹膜炎[17-21]。其中LPS/D-GalN誘發(fā)的急性致

2、死性肝損傷模型是一種被廣泛使用了20多年的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,其機(jī)制是導(dǎo)致急性肝功能衰竭而死亡,被認(rèn)為與人類基于內(nèi)毒素血癥或敗血癥合并肝衰竭相關(guān)[22,23],如人類全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)在非感染狀態(tài)下可出現(xiàn)類似敗血癥表現(xiàn)[24]。因此,該模型被用于研究內(nèi)毒素血癥合并急性肝損傷的機(jī)理、治療策略與藥物篩選。我們的研究中采用的另一個(gè)經(jīng)典模型是有酵母多糖誘發(fā)的腹膜炎,屬相對(duì)溫和的非致死性的急性炎癥。
　　 在觀察并確定了水合氯醛可干

3、預(yù)兩種模型動(dòng)物炎癥的一般表現(xiàn)與指標(biāo)的同時(shí),我們對(duì)其作用機(jī)制做了初步的探索,其重點(diǎn)放在LPS/D-GalN誘發(fā)的急性致死性肝損傷模型。主要包括促炎癥細(xì)胞因子水平及核因子rappaB(NF-kB)的活性改變。參考Bozza等對(duì)臨床敗血性休克患者的預(yù)后相關(guān)細(xì)胞因子譜的研究,我們選擇IL-6,腫瘤壞死因子α(TNF-α)和MCP-1做為檢測評(píng)價(jià)指標(biāo)[25]。其中,TNF-α已被證明和LPS/D-GalN攻擊小鼠后生存率密切相關(guān)[26]。MCP-

4、1在急性致死性炎癥如敗血癥中是一個(gè)重要的細(xì)胞因子,可平衡促炎和抗炎反應(yīng)[27]。
　　 在明確水合氯醛的體內(nèi)保護(hù)作用的基礎(chǔ)上,我們?cè)O(shè)計(jì)了探討機(jī)制的體外實(shí)驗(yàn)。具體為用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察水合氯醛體外作用對(duì)這兩種細(xì)胞NF-kB炎癥信號(hào)分子激活和炎癥因子生成的影響。
　　 第一章 水合氯醛對(duì)LPS/D-GalN誘發(fā)致死性肝損傷和zymosan誘發(fā)腹膜炎小鼠模型的保護(hù)作用
　

5、　 基于本研究采用水合氯醛(chloral hydrate,CH)一次性干預(yù)模式,在短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用,研究模型之一首先選擇較嚴(yán)重的急性重癥炎癥模型:LPS2630(10μg)/D-GalN(800mg/Kg)誘發(fā)的急性致死性肝損傷模型(中位生存時(shí)間9.20h)[1]。用CH以不同劑量(80,160和320mg/Kg)在LPS/D-GalN攻擊后不同時(shí)間點(diǎn)(0,1,3和5h)體內(nèi)一次性干預(yù),發(fā)現(xiàn)CH干預(yù)以劑量依賴的方式延長小鼠的生存時(shí)間

6、,以160和320mg/Kg組存在顯著差異(分別P=0.024,P=0.001)。同一劑量(320mg/kg)在LPS/D-GalN攻擊后0,1,和3h干預(yù)與對(duì)照組比較顯著延長小鼠生存時(shí)間(分別P=0.002,P=0.004和P=0.002)。干預(yù)組3h點(diǎn)MCP-1,IL-6和TNF-α的水平顯著低于對(duì)照組,而后IL-6和TNF-α在6h點(diǎn)逐漸上升顯著高于對(duì)照組。干預(yù)組ALT在干預(yù)后3,6和9h點(diǎn),均顯著低于對(duì)照組,而AST9h點(diǎn)顯著低

7、于對(duì)照組。肝臟充血程度在9h點(diǎn)干預(yù)組較對(duì)照組顯著減輕,HE染色顯示兩組均有肝臟小葉結(jié)構(gòu)破壞和嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死和出血,在6和9h點(diǎn)對(duì)照組顯著嚴(yán)重于干預(yù)組。兩組血清皮質(zhì)酮水平無顯著差異,但干預(yù)組均低于對(duì)照組。而用有效干預(yù)劑量CH(320mg/Kg)被證明處理正常小鼠是安全的。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了CH(320mg/Kg)可有效抑制zymosan A誘發(fā)的急性腹膜炎[20]。表現(xiàn)為干預(yù)組腹腔滲出液白細(xì)胞總數(shù)高峰顯著推遲至少16h,在

8、5和8h點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著減少(分別P=0.03,P=0.006)。腹腔滲出液蛋白含量結(jié)果類似,高峰值延遲約4h,尤其是在0.5和1h點(diǎn)兩組有顯著差異急性腹膜炎小鼠誘發(fā)后1,2和8h點(diǎn),TNF-α,MCP-1和IL-6的水平均顯著低于對(duì)照組。
　　 本章工作證明水合氯醛(320mg/Kg)體內(nèi)干預(yù)對(duì)LPS/D-GalN誘發(fā)的急性致死性肝損傷和zymosan誘發(fā)急性腹膜炎小鼠具有顯著的保護(hù)作用,可以顯著降低和延遲炎癥相關(guān)因子的

9、產(chǎn)生。
　　 第二章 水合氯醛干預(yù)對(duì)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子NF-κB抑制的體內(nèi)外研究
　　 基于CH(320mg/Kg)一次性體內(nèi)應(yīng)用可改變LPS/D-GalN誘發(fā)致死性肝損傷和zymosan誘發(fā)腹膜炎模型小鼠血液中炎癥因子TNF-α,IL-6和MCP-1的水平。推測CH干預(yù)是否與抑制炎癥因子合成的關(guān)鍵上游控制元件NF-κB有關(guān)。為證實(shí)這一推測設(shè)計(jì)了以整體成像技術(shù)與體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞系研究NF-κB活性。
　　 體內(nèi)研究選擇

10、NF-κB轉(zhuǎn)基因小鼠NF-κB-RE-RE-luc(Oslo),用LPS/D-GalN誘發(fā)急性致死性肝損傷(同前),CH(320mg/Kg)干預(yù)顯著降低LPS/D-GalN誘發(fā)的NF-κB轉(zhuǎn)基因小鼠NF-κB控制下的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。無干預(yù)對(duì)照組熒光素酶表達(dá)在4h點(diǎn)達(dá)到高峰,干預(yù)組在3,4,5和6h點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組(均為P=0.000)。肝臟,腸道和肺臟為主要受累器官,CH干預(yù)能顯著降低受累器官熒光素酶表達(dá)(分別P=0.002,

11、P=0.026,P=0.015)。
　　 體外細(xì)胞模型研究采用轉(zhuǎn)染NF-κB熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒RAW264.7細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。結(jié)果表明:CH(0.5和1 mg/ml)干預(yù)顯著降低由LPS/LTA刺激轉(zhuǎn)染NF-κB熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒RAW264.7的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)活性。顯著抑制LPS/LTA刺激腹腔巨噬細(xì)胞IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。
　　 本章通過體內(nèi)外即整體與細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)CH干預(yù)可以顯著抑制由LPS/D

12、-GalN,LPS和LTA刺激引起的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子NF-κB活性,以及下游炎癥因子的生成。
　　 第三章 CH誘發(fā)單個(gè)核細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究
　　 體外選擇CH不同濃度(0.25,1和2 mg/ml)在體外對(duì)RAW264.7細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。采用觀察細(xì)胞形態(tài)和功能(如吞噬功能)改變,早期凋亡檢測,Hochest 33258染色,DNA ladder等多種方法驗(yàn)證是否確實(shí)引起了靶細(xì)胞的凋亡這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

13、　　 結(jié)果顯示:CH處理RAW264.7細(xì)胞形態(tài)由典型的梭形,變圓直至脫落懸浮;PI/FITC染色經(jīng)流式檢測顯示CH誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞從早期向晚期凋亡的轉(zhuǎn)換過程,并可被典型的DNA ladder所證實(shí)；Hochest 33258染色發(fā)現(xiàn)核明顯固縮密度增加、凝聚和斷裂；而且吞噬能力較正常對(duì)照被顯著抑制。CH處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞具有同樣的誘導(dǎo)凋亡效果。此外,CH(320mg/Kg)干預(yù)LPS/D-GalN誘發(fā)致死性肝損傷小鼠的脾臟單

14、個(gè)核細(xì)胞凋亡,干預(yù)組在2和3h點(diǎn)較對(duì)照組顯著誘發(fā)了脾臟單個(gè)核細(xì)胞的早期凋亡(分別P=0.001,P=0.000)。
　　 為闡明CH以何種方式誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡,用RAW264.7細(xì)胞為模型在體外研究,同時(shí)觀察無干預(yù)及CH(320mg/Kg)干預(yù)的正常小鼠與肝損傷小鼠的脾臟組織切片。發(fā)現(xiàn)體外CH(0.5和1mg/ml)處理RAW264.7細(xì)胞12和24h均可誘發(fā)RAW264.7表達(dá)Fas,但不表達(dá)FasL；Fas在正常小鼠脾臟少量

15、表達(dá),水合氯醛(320mg/Kg)一次性干預(yù)9h后,其脾臟細(xì)胞Fas表達(dá)顯著升高。
　　 本章采用多種方法檢測體外RAW264.7細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞,體內(nèi)模型的小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞以及脾臟的凋亡,證明水合氯醛在體外干預(yù)可以誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞從早期到晚期的典型凋亡過程,且同時(shí)高表達(dá)Fas。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)都表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。小鼠生存時(shí)間分析采用Kaplan-Meier分析進(jìn)行對(duì)照組

16、和CH干預(yù)組比較,顯著性差異用Breslow檢驗(yàn)。相同時(shí)間點(diǎn)CH干預(yù)組和對(duì)照組各因素比較使用獨(dú)立樣本t(Independent-student Ttest)檢驗(yàn)。對(duì)照組(NS)和水合氯醛干預(yù)組(CH)RAW264.7細(xì)胞熒光信號(hào)relativelight unit(RLU)(fold change)比較用one-way ANOVA。處理軟件均為SPSS 13.0,P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。
　　 結(jié)論
　　 研究發(fā)現(xiàn)

17、CH(320mg/Kg)干預(yù)可以保護(hù)由LPS/D-GalN攻擊小鼠的急性致死性肝損傷,顯著延長其生存時(shí)間；且在急性致死性肝損傷誘導(dǎo)后1到3個(gè)h進(jìn)行干預(yù)仍然顯著有效。CH(320mg/Kg)干預(yù)可以減輕zymosan A誘發(fā)的急性非致死性腹膜炎小鼠的炎癥程度。CH(320mg/Kg)干預(yù)可降低和延遲以上2個(gè)急性炎癥模型小鼠血清促炎細(xì)胞因子IL-6,TNF-α,MCP-1水平,降低肝損傷小鼠肝臟病理損傷程度。
　　 采用整體成像技術(shù)

18、證實(shí)CH(320mg/Kg)干預(yù)可以保護(hù)NF-κB轉(zhuǎn)基因小鼠,抑制由LPS/D-GalN誘發(fā)的NF-κB分子的活性。體外細(xì)胞水平研究證實(shí)CH(0.5mg/ml)處理轉(zhuǎn)染NF-κB熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的RAW264.7細(xì)胞,可抑制由LPS和LTA刺激引起的胞內(nèi)NF-κB活性。同時(shí)CH(0.5和1mg/ml)處理腹腔巨噬細(xì)胞,可抑制由LPS和LTA刺激誘發(fā)的IL-6和TNF-α的生成。采用多種凋亡檢測方法證實(shí)CH干預(yù)可以誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞