胍丁胺對急性小鼠腹膜炎炎性損傷的保護效應及其機制研究.pdf

1、目的：
　　探索胍丁胺（AGM）對酵母多糖（ZYM）誘導急性小鼠腹膜炎炎性損傷的保護效應及其相關機制。
　　方法：
　　1、將72只成年雄性C57BL/6小鼠隨機分為假手術組（18只，腹腔注入磷酸鹽緩沖液）、ZYM模型組（18只，腹腔注入1mg/ml的酵母多糖溶液0.5ml）、AGM干預組（18只，腹腔注入1mg/ml的酵母多糖溶液0.5ml和胍丁胺溶液400mg/kg）和AGM對照組（18只，腹腔注入胍丁胺溶液400

2、mg/kg），各組分別于建模后2h、6h、24h處死6只小鼠，采集外周血、腹腔灌洗液、肝組織。在處死小鼠前定時察看小鼠精神活動狀態(tài)。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清、腹腔灌洗液及肝勻漿中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、角化細胞來源趨化因子（KC）、巨噬細胞炎性蛋白-2（MIP-2）含量；血細胞計數(shù)板計數(shù)腹腔灌洗液中浸潤炎性細胞總數(shù)；流式細胞術分析腹腔浸潤的 PMN比例；全自動生物化學分析儀檢測血清

3、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉氨酶（AST）、肌酐（Crea）、尿素氮（Urea）濃度。
　　2、分離小鼠骨髓PMN和腹腔原代巨噬細胞，分別培養(yǎng)于Transwell小室的上下室， ZYM刺激下室的腹腔巨噬細胞，在加或不加胍丁胺干預的情況下，在40分鐘后用DAPI染色，倒置熒光顯微鏡下察看各組PMN趨化數(shù)目。
　　3、分離并體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞，采用100μg/ml的酵母多糖溶液刺激，在AGM治療的情況下，于不同時間

4、點收集細胞蛋白及細胞培養(yǎng)上清。ELISA檢測細胞上清中TNF-α、IL-6、KC、MIP-2蛋白的濃度，逆轉錄PCR（qPCR）檢測細胞中TNF-α、IL-6、KC、MIP-2 mRNA的表達量，免疫印跡法（Western Blot）檢測胞漿胞核中iNOS、p65、p-p65的表達水平。此外，分別應用N-甲基D-天冬氨酸受體(NMDA-R)拮抗劑 MK-801、α2腎上腺素能受體拮抗劑育亨賓（YHB）、咪唑啉1受體（I1-R）高親和力配

5、基依法克生（EFA）及咪唑啉2受體（I2-R）高親和力配基咪唑克生（IDA）預作用巨噬細胞，有或無胍丁胺治療的條件下，檢測ZYM刺激12h后培養(yǎng)上清中IL-6、KC的濃度。
　　結果：
　　1、在酵母多糖攻擊2h、6h、24h后ZYM模型組和AGM治療組小鼠均表現(xiàn)出行動緩慢，反應遲鈍，蜷縮成團，腹瀉，飲食減少，且隨著時間推移癥狀愈發(fā)明顯，但AGM干預組小鼠精神和活動狀態(tài)明顯好于ZYM模型組。與對照組比較，AGM治療可顯著降低

6、ZYM刺激2h后小鼠血清中趨化因子KC（pg/ml:1578.8±107.3比2077.4±196.3，P＜0.05）、MIP-2（pg/ml:743.5±77.9比937.6±89.6，P＜0.05）的濃度和腹腔灌洗液中趨化因子KC（pg/ml:6064.3±577.4比9864.7±851.8，P＜0.05）、MIP-2（pg/ml:1763.4±125.7比2369.7±304.5，P＜0.05）的濃度；降低 ZYM攻擊6h后小鼠

7、血清中 TNF-α（ pg/ml:513.7±38.5比822.1±47.8，P＜0.05）、IL-6（pg/ml:945.4±107.9比1326.4±178.5，P＜0.05）的濃度和腹腔灌洗液中炎癥因子 TNF-α（pg/ml:1661.7±185.4比2812.5±216.4，P＜0.05）、IL-6（pg/ml:11694.1±1503.2比21170.7±3872.4， P＜0.05）的含量以及腹腔灌洗液中白細胞總數(shù)（×10

8、6/ml：10.1±1.2比14.7±1.1，P＜0.05）和中性粒細胞比例(百分比％：77.83%比90.07%， P＜0.05)；削弱ZYM攻擊24h后肝組織勻漿中TNF-α(ng/g:281.6±20.8比358.5±25.3，P＜0.05)和 IL-6(ng/g:197.4±22.7比273.5±26.7，P＜0.05)、趨化因子 KC(ng/g:47.2±11.9比77.4±20.3， P＜0.05)和MIP-2(ng/g:6

9、7.4±14.6比103.7±19.2，P＜0.05)的升高(均P＜0.05)；降低ZYM刺激24h后血清中ALT(U/L:392.6±41.4比712.3±55.5，P＜0.05)、AST(U/L:494.7±34.3比681.7±38.6，P＜0.05)、Urea(mmol/L:31.3±1.8比46.8±3.9，P＜0.05)、Crea(μmol/L:32.5±1.9比38.2±2.7，P＜0.05)的濃度。
　　2、在體外

10、Transwell趨化實驗中我們發(fā)現(xiàn)，ZYM組巨噬細胞上清誘導的PMN趨化數(shù)目與對照組相比顯著增多，但ZYM+AGM組巨噬細胞培養(yǎng)上清誘導的PMN遷移趨化數(shù)目與ZYM組相比極大減少。
　　3、在體外小鼠腹腔原代巨噬細胞培養(yǎng)實驗中，采用ZYM刺激原代巨噬細胞并經AGM治療發(fā)現(xiàn)，細胞TNF-α、IL-6、KC、MIP-2的蛋白釋放量和mRNA合成量均大大降低，且細胞中iNOS表達量減少， p65磷酸化和入核受到抑制。此外，ZYM作用小

11、鼠原代腹腔巨噬細胞12h后，AGM、MK-801、IDA處理均能抑制巨噬細胞培養(yǎng)上清中IL-6、KC的上升，其中MK-801抗炎效果弱于AGM，AGM與MK-801聯(lián)用有一定程度的聯(lián)合抗炎效果，而IDA的抗炎效果與AGM類似，且AGM與IDA聯(lián)用時聯(lián)合抗炎效果不明顯；YHB、EFA無抑制炎癥效果，并對AGM的抗炎效應亦無影響。
　　結論：
　　1、AGM能降低 ZYM引起的腹膜炎小鼠血清和腹腔灌洗液中TNF-α、IL-6及趨

12、化因子KC、MIP-2的生成，降低腹腔炎性細胞總數(shù)及抑制腹腔PMN的浸潤，表明AGM有著良好的全身與局部抗炎作用。
　　2、AGM能降低ZYM誘導腹膜炎小鼠血清中ALT、AST、Urea、Crea的升高，減輕肝臟中炎癥因子和趨化因子表達水平，表明 AGM對腹膜炎小鼠臟器功能損害有一定的保護作用。
　　3、AGM能減少ZYM體外刺激下小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-6、KC、MIP-2的蛋白釋放量和mRNA生成量，抑制iNO