胍丁胺對炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分胍丁胺對炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用及對嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響 目的:在福爾馬林致大鼠炎性疼痛模型上，觀察胍丁胺對炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用及其對嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響，并研究胍丁胺鎮(zhèn)痛與增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛的作用是否與激動(dòng)咪唑啉受體有關(guān)。方法:SD大鼠，雄性，180-220克。右側(cè)足底皮下注射5％的福爾馬林50μL致痛，測定大鼠不同疼痛行為反應(yīng)持續(xù)的時(shí)間，計(jì)算痛級(jí)均數(shù)和大鼠舔足時(shí)間的總和。①胍丁胺對炎性疼痛的作用：皮下注射20、40、80、160mg/

2、kg胍丁胺20min或腹腔注射10、20、40、80、120、160mg/kg胍丁胺15min后，用福爾馬林致痛；②胍丁胺對嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響：皮下注射胍丁胺40、80、120、160mg/kg后5min，皮下注射嗎啡1mg/kg，15min后用福爾馬林致痛；或腹腔注射胍丁胺10、20、40、80mg/kg并同時(shí)皮下注射嗎啡1mg/kg，15min后用福爾馬林致痛；③胍丁胺鎮(zhèn)痛與增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛作用與咪唑啉受體的關(guān)系：咪唑克生5mg/kg腹

3、腔注射5min后，腹腔注射胍丁胺160mg/kg，15min后用福爾馬林致痛；或咪唑克生5mg/kg腹腔注射5min后，腹腔注射胍丁胺20mg/kg，同時(shí)皮下注射嗎啡1mg/kg，15min后用福爾馬林致痛。結(jié)論:胍丁胺對福爾馬林引起的第二期疼痛及痛敏行為有明確的抑制作用，并明顯增強(qiáng)嗎啡的鎮(zhèn)痛效果，而對第一期疼痛反應(yīng)無效。其抗炎性疼痛的機(jī)理可能與咪唑啉受體無關(guān)。 第二部分胍丁胺鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的研究. 實(shí)驗(yàn)1胍丁胺對基礎(chǔ)和高

4、鉀誘發(fā)脊髓內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響. 目的:探討胍丁胺對脊髓谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)基礎(chǔ)釋放量的影響和胍丁胺對高鉀誘發(fā)神經(jīng)元去極化引起神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響。從受體前水平探討胍丁胺的鎮(zhèn)痛機(jī)制。方法:S.D大鼠，雄性，180-220克，取腰段脊髓進(jìn)行人工切片，隨機(jī)分為5組。將脊髓片置于持續(xù)通入95％02和5％C02，37℃保溫的人工腦脊液(ACSF)中平衡40min，收集第41-50min的脊髓片孵育液，測定相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的濃度

5、作為基礎(chǔ)釋放量。在觀察胍丁胺對脊髓谷氨酸和GABA基礎(chǔ)釋放量的影響的實(shí)驗(yàn)中，在上述實(shí)驗(yàn)過程的基礎(chǔ)上，將ACSF置換成含胍丁胺0，1，10，100，1000μmol/L的ACSF(0.5mL)，孵育10min，收集孵育液。在觀察胍丁胺對高鉀誘發(fā)神經(jīng)元去極化引起神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響實(shí)驗(yàn)中，將ACSF置換成含胍丁胺和KCl50mmol/L的高鉀ACSF(NaCl相應(yīng)降低濃度)，孵育10min，收集:胍丁胺的鎮(zhèn)痛作用不是通過在受體前水平抑制谷氨酸

6、或促進(jìn)GABA釋放來實(shí)現(xiàn)的。 實(shí)驗(yàn)2胍丁胺對谷氨酸和高鉀誘發(fā)海馬神經(jīng)元[Ca2+]i升高的影響. 目的:觀察胍丁胺對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響及對谷氨酸和高鉀誘發(fā)海馬神經(jīng)元[Ca2+]i升高的影響，探討胍丁胺對N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體和電壓依賴性鈣通道(VDCC)的作用。方法:新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)至第10天，用Fluo-3/AM熒光染料進(jìn)行負(fù)載后，在激光共聚焦顯微

7、鏡下進(jìn)行動(dòng)態(tài)掃描。實(shí)時(shí)觀察1min后向細(xì)胞外液中加入終濃度分別為0，1，10，100，1000μmol/L的胍丁胺。待胍丁胺充分作用于細(xì)胞后，用300μmol/L谷氨酸誘發(fā)NMDA受體通道的開放，用50mmol/LKCl誘發(fā)VDCC的開放，觀察并記錄[Ca2+]i的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)論:胍丁胺對VDCC的作用不明顯，其鎮(zhèn)痛機(jī)理可能與阻斷NMDA受體耦聯(lián)鈣離子通道而抑制了鈣離子的內(nèi)流有關(guān)。 實(shí)驗(yàn)3胍丁胺對福爾馬林致炎性疼痛脊髓蛋白激酶C

8、γ表達(dá)變化的影響. 目的:驗(yàn)證福爾馬林致炎性疼痛脊髓蛋白激酶Cγ(PKCγ)激活及膜轉(zhuǎn)位的變化，并探討胍丁胺對其的影響。方法SD大鼠，雄性，180-220克，隨機(jī)分為3組：①對照組；②福爾馬林組；③胍丁胺(160mg/kg，i.p.)-福爾馬林組。足底注射5％福爾馬林50μL后10min取L4,5脊髓，通過免疫組化、免疫熒光和超速離心法分別提取膜蛋白和胞漿蛋白進(jìn)行免疫印記研究，確定PKCγ在脊髓的表達(dá)部位，檢測福爾馬林致炎性疼痛

9、脊髓PKCγ蛋白表達(dá)的變化及胍丁胺對其的影響。結(jié)論:炎性疼痛引起脊髓PKCγ表達(dá)上調(diào)并發(fā)生膜轉(zhuǎn)位可能參與疼痛及痛覺過敏的產(chǎn)生。胍丁胺的鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與抑制疼痛引起的脊髓PKCγ的表達(dá)上調(diào)及膜轉(zhuǎn)位有關(guān)。 實(shí)驗(yàn)4胍丁胺對福爾馬林致炎性疼痛脊髓pERK表達(dá)變化的影響. 目的:研究福爾馬林致炎性疼痛脊髓磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(pERK)表達(dá)的變化及胍丁胺對其的影響。方法SD大鼠，雄性，180-220克，24只，隨機(jī)分為3組，n

10、=8，分組方法同實(shí)驗(yàn)3。足底注射5％福爾馬林50μL后8min取L4,5脊髓做石蠟切片，按照標(biāo)準(zhǔn)免疫組化法檢測各組脊髓切片中pERK的表達(dá)情況。結(jié)論:炎性疼痛引起脊髓pERK蛋白表達(dá)升高可能參與疼痛及痛敏的形成，pERK可能參與了胍丁胺鎮(zhèn)痛機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)5胍丁胺對福爾馬林致炎性疼痛脊髓pCREB表達(dá)變化的影響. 目的:測定福爾馬林致炎性疼痛脊髓磷酸化的環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(pCREB)表達(dá)的變化及胍丁胺對其的影響。方

11、法:動(dòng)物與分組方法同實(shí)驗(yàn)3。足底注射5％福爾馬林50μL后20min取L4,5脊髓，分左右兩側(cè)，裂解并離心后提取總蛋白，應(yīng)用免疫印記法測定各組脊髓中pCREB的表達(dá)量。結(jié)論:炎性疼痛引起脊髓pCREB蛋白表達(dá)升高，并可被胍丁胺所抑制，提示pCREB可能參與了胍丁胺的鎮(zhèn)痛機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)6胍丁胺對福爾馬林致炎性疼痛脊髓c-Fos和c-Jun表達(dá)變化的影響. 目的:研究胍丁胺對炎性疼痛過程中即刻早期基因表達(dá)變化的影響。方法動(dòng)物與