前列腺炎性疼痛神經(jīng)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的：慢性前列腺炎是泌尿外科極其常見的疾病，疼痛是其最主要癥狀也是影響患者生活質(zhì)量最重要的因素，目前對(duì)其發(fā)生、發(fā)展的神經(jīng)機(jī)制仍不清楚。慢性前列腺炎疼痛表現(xiàn)為典型的內(nèi)臟牽涉痛特點(diǎn)，常常伴有排尿功能障礙(如尿頻、尿急、尿不盡等)，且與盆底肌功能障礙關(guān)系密切。疼痛是一種神經(jīng)事件，前列腺炎、膀胱炎及盆底肌功能障礙之間在疼痛癥狀上的相關(guān)性應(yīng)有其神經(jīng)學(xué)的基礎(chǔ)。 ATP既是細(xì)胞內(nèi)能量的來源，也是一種重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，它通過P2X受體介導(dǎo)誘

2、發(fā)快速和慢速內(nèi)向激活電流使DRG神經(jīng)元去極化。P2X3受體選擇性地表達(dá)在DRG神經(jīng)元中與疼痛感覺相關(guān)的中、小神經(jīng)元。對(duì)外周神經(jīng)和組織的刺激如炎癥、神經(jīng)病變可以引起夸大的對(duì)傷害性和非傷害性刺激的反應(yīng)(痛覺過敏和痛覺異常)，這些病理過程被認(rèn)為是由于P2X介導(dǎo)的DRG及脊髓背角神經(jīng)元對(duì)外界刺激興奮性增強(qiáng)引起。慢性前列腺炎疼痛往往與前列腺局部的炎癥程度不一致，甚至在前列腺炎癥消失后疼痛仍持續(xù)存在，產(chǎn)生痛覺過敏及痛覺異常。其中可能發(fā)生了P2X介導(dǎo)

3、的DRG細(xì)胞興奮性的增加以及P2X3表達(dá)的改變，但相關(guān)研究國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。 最新研究表明，脊髓膠質(zhì)細(xì)胞(主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)的激活與痛覺過敏的產(chǎn)生和疼痛持續(xù)狀態(tài)有密切的關(guān)系。慢性前列腺炎疼痛常表現(xiàn)為慢性持續(xù)性疼痛和疼痛過敏，有可能與脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化存在一定關(guān)系，而國內(nèi)外目前還未見相關(guān)報(bào)道。 通過研究，有望為慢性前列腺炎疼痛尋找神經(jīng)病理學(xué)的證據(jù)并為臨床診治提供新的靶位線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料及方法

4、：用辣椒素對(duì)S-D大鼠前列腺和膀胱進(jìn)行疼痛刺激，觀察體表伊文氏藍(lán)染色情況并進(jìn)行分析。福爾馬林刺激前列腺、膀胱及盆底肌，用原位雜交方法檢測(cè)刺激后脊髓P物質(zhì)(SP)表達(dá)的變化情況。用完全弗氏佐劑(CFA)注入S-D大鼠前列腺造成炎性疼痛，用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)、蛋白免疫印跡(Westernblot)及免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)不同時(shí)間急性分離的L6-S1節(jié)段DRG細(xì)胞ATP所激發(fā)的反應(yīng)及P2X3的表達(dá)及分布情況進(jìn)行檢測(cè)。用CFA注入S-D大鼠前列腺

5、，用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)不同時(shí)間段大鼠相應(yīng)脊髓節(jié)段(L6和S1)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：主要研究結(jié)果如下：1.辣椒素刺激大鼠前列腺導(dǎo)致L5-S2(主要位于L6及S1)體表節(jié)段的血漿滲出；接受膀胱刺激的大鼠其血漿滲出的體表節(jié)段分布與前列腺接受刺激的大鼠相似。 2.福爾馬林刺激大鼠前列腺、膀胱及尾根部(大鼠的盆底肌)均引起L6及S1脊髓背角P物質(zhì)表達(dá)的顯著增加。其中增加百分比最多的是在背角深層，包括背聯(lián)

6、合及骶副交感核區(qū)域。 3.CFA刺激大鼠前列腺3天及10天時(shí)，前列腺局部顯示明顯的炎癥反應(yīng)；相應(yīng)節(jié)段(L6、S1)DRG顯示SP表達(dá)明顯增加。 4.在倒置顯微鏡下觀察，急性分離得到的DRG神經(jīng)元有大、中、小三種類型，平均直徑分別為41-60μm、30～40μm、13～29μm。細(xì)胞表面光滑，胞體呈橢圓形、圓形，多為單極突起，CFA刺激前列腺后DRG神經(jīng)元的形態(tài)無顯著變化。 5.膜片鉗全細(xì)胞模式記錄到對(duì)照組、CFA

7、刺激3d組、刺激10d組DRG神經(jīng)元靜息膜電位、串聯(lián)阻抗、膜電容之間無顯著差異，也就是說CFA刺激大鼠前列腺后DRG神經(jīng)元的被動(dòng)膜電生理特性無顯著變化(p＞0.05)。 電流鉗下，給予DRG神經(jīng)元一系列由超級(jí)化至去極化的階躍電流(-60pA～140pA，step=20pA，時(shí)長200ms)刺激，記錄得到動(dòng)作電位。CFA刺激前列腺3d后DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢婚撝?、時(shí)程無顯著變化(p＞0.05)；而刺激10d后DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢婚撝?/p>

8、、時(shí)程發(fā)生明顯變化，與對(duì)照組比較差異顯著(p＜0.01)。 6.電流鉗下，DRG神經(jīng)元膜電位出現(xiàn)自主波動(dòng)。對(duì)照組、CFA刺激3d組神經(jīng)元膜電位波動(dòng)幅度較小，不能達(dá)到閾值產(chǎn)生動(dòng)作電位。而刺激10d后神經(jīng)元膜電位波動(dòng)明顯，約有10.26％(4/39)神經(jīng)元膜電位波動(dòng)幅度達(dá)到閾值出現(xiàn)自發(fā)性電活動(dòng)。 7.ATP能夠興奮DRG神經(jīng)元，而P2X受體拮抗劑suramin可以抑制ATP的興奮作用。在電流鉗下，DRG神經(jīng)元鉗制電壓保持在-

9、60mV，0.1μM、1μM、10μM、100μMATP均可引起神經(jīng)元膜電位發(fā)生去極化反應(yīng)。不同濃度ATP引起同組細(xì)胞之間去極化反應(yīng)幅度及相同濃度ATP引起對(duì)照組及CFA刺激前列腺10d兩組細(xì)胞之間去極化反應(yīng)幅度均有顯著差異(p＜0.01)。CFA刺激前列腺前后ATP誘發(fā)DRG神經(jīng)元膜電位去極化反應(yīng)的半量有效濃度(EC50)分別為4.26±1.69μM和1.10±0.90μM，兩組差異顯著(p＜0.01)。 8.電壓鉗下，DRG

10、神經(jīng)元鉗制電壓保持在-60mV，0.1μM、1μM、10μM、100μMATP均可引起神經(jīng)元產(chǎn)生內(nèi)向電流。不同濃度ATP引起同組細(xì)胞之間產(chǎn)生內(nèi)向電流反應(yīng)幅度及相同濃度ATP引起對(duì)照組及CFA刺激前列腺后10d兩組細(xì)胞之間產(chǎn)生內(nèi)向電流反應(yīng)幅度均有顯著差異(p＜0.01)。CFA刺激前后ATP激發(fā)DRG神經(jīng)元產(chǎn)生內(nèi)向電流的半量有效濃度(EC50)分別為4.07±1.38μM和1.26±0.90μM，兩組差異顯著(p＜0.01)。 實(shí)

11、驗(yàn)還觀察到對(duì)照組神經(jīng)元32％(8/25)為快反應(yīng)電流，54.17％(13/24)為慢反應(yīng)電流。CFA刺激10d組神經(jīng)元36％(9/25)為快反應(yīng)電流，52％(13/25)為慢反應(yīng)電流。CFA刺激前列腺后快、慢反應(yīng)電流所占百分比率無顯著差異(p＞0.05)。 9.CFA刺激前列腺后3天時(shí)，Westernblot檢測(cè)P2X3蛋白表達(dá)有所增加，但與對(duì)照組之間無顯著差異，炎癥10天后P2X3蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比顯著增加。免疫組織化學(xué)檢測(cè)

12、對(duì)照組及炎癥后10d組P2X3受體的表達(dá)，顯示炎癥后10天P2X3表達(dá)顯著高于對(duì)照組，得到了與Westernblot蛋白印跡檢測(cè)一致的結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)P2X3陽性細(xì)胞選擇性表達(dá)在中、小直徑的傷害感覺細(xì)胞。 10.CFA刺激大鼠前列腺后3天、10天、28天，L6-S1脊髓背角淺層和深層星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化與對(duì)照組相比均顯著增加，其中3天時(shí)增加最強(qiáng)，10、28天時(shí)有所下降，但仍顯著高于對(duì)照組。 結(jié)論：1.化學(xué)刺激前列

13、腺及膀胱腔引起相似的脊髓體表節(jié)段(L6及S1)的神經(jīng)源性的血漿滲出范圍，提示兩種牽涉痛是神經(jīng)源性介導(dǎo)的，且與臨床上前列腺炎牽涉痛的部位范圍一致?；瘜W(xué)刺激前列腺、膀胱腔及盆底肌引起L6～S1脊髓節(jié)段背角淺層及深層P物質(zhì)表達(dá)的顯著增加。提示L6及S1是前列腺、膀胱及盆底肌三者共同主要的感受其疼痛刺激的脊髓中樞，接受盆部臟神經(jīng)及體神經(jīng)傷害刺激沖動(dòng)的神經(jīng)元在L6及S1脊髓節(jié)段有顯著的重疊；前列腺、膀胱及盆底肌三者的疼痛刺激可以相互聯(lián)系并互相影響

14、，與臨床上觀察到的現(xiàn)象一致。 2.CFA炎性疼痛刺激前列腺早期(3天)L6及S1背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元P2X3受體無顯著變化；中期(10天)ATP對(duì)P2X受體的親和力、敏感性及P2X3的表達(dá)均顯著增加并出現(xiàn)了DRG神經(jīng)元自發(fā)放電現(xiàn)象。表明前列腺炎一定時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)痛覺過敏及自發(fā)性疼痛。符合臨床上前列腺炎局部炎癥程度與疼痛程度不一致，甚至有些炎癥消失疼痛依舊存在的特點(diǎn)。提示P2X受體的敏感性及表達(dá)的增加在前列腺炎疼痛的發(fā)生及維持