SAPAP3基因敲除小鼠中的皮層—紋狀體突觸功能缺陷和類OCD行為.pdf

1、了解突觸行使生理功能的分子機(jī)制對于闡明神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元如何進(jìn)行相互的信息交流具有重要意義。目前對于突觸后分子的裝配以及功能的了解仍不深入。人們已知突觸后組織大約由數(shù)百個(gè)蛋白質(zhì)組成，但對這些蛋白的生理功能仍所知甚少。目前僅初步了解了其中的極少數(shù)蛋白的生理功能。目前比較流行的突觸發(fā)育的模式是一群主要的支架蛋白通過提供多個(gè)錨定位點(diǎn)和與肌動蛋白細(xì)胞骨架連接位點(diǎn)，將大分子復(fù)合物裝配在突觸后膜。本文的目的是研究作為關(guān)鍵的突觸后蛋白之一，SAPAP(

2、SAP90／PSD95 associated protein)蛋白家族在體內(nèi)的生理功能，以此作為進(jìn)一步深入研究突觸后蛋白分子裝配及功能的基礎(chǔ)。我們綜合應(yīng)用了遺傳學(xué)，生物化學(xué)，電生理學(xué)以及行為學(xué)的研究方法來闡明SAPAP3蛋白在突觸發(fā)育和功能中的作用，并研究了SAPAP3蛋白與類強(qiáng)迫性神經(jīng)癥(Obsessive-compulsive disorder，OCD)行為的關(guān)系。 為了研究SAPAP蛋白家族的體內(nèi)生理功能，我們首先制備了S

3、APAP3基因敲除小鼠(SAPAP3 knock out小鼠，以下均稱為SAPAP3突變小鼠)。并用尾巴PCR和Southern印跡和Western印跡法進(jìn)行了驗(yàn)證。SAPAP3突變小鼠總體上是正常的并能正常生育，但是在達(dá)到4—8月的年齡的時(shí)候，這些基因敲除小鼠100％表現(xiàn)出臉部和頸部等部位損傷的情況。這些損傷是這些基因敲除小鼠的自我損傷，這提示這些小鼠可能具有某些行為上的病理性缺陷。通過對24小時(shí)錄像解碼的分析發(fā)現(xiàn)，SAPAP3突變小

4、鼠與野生型小鼠相比，梳理行為的次數(shù)和時(shí)間顯著增加。重要的是，SAPAP3突變小鼠在發(fā)生臉、頸等部位損傷前和發(fā)生損傷后具有相同程度的梳理行為。這些數(shù)據(jù)證明SAPAP3突變小鼠有病理意義的梳理行為。為了研究是否這些SAPAP3突變小鼠有增高的焦慮水平，我們做了開放場試驗(yàn)(open field test)， O型迷宮試驗(yàn)(elevated zero maze test)，和暗／亮箱試驗(yàn)(dark to light emergence test

5、)。在所有這三個(gè)試驗(yàn)中，SAPAP3突變小鼠都表現(xiàn)出增高的焦慮水平。 SAPAP3突變小鼠的這種過度梳理行為和增高的焦慮水平讓人聯(lián)想起人類OCD類疾病的癥狀。由于選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(Selective SerotoninReuptake Inhibitor(SSRI))被廣泛應(yīng)用于治療OCD病人并且在50％的病人中有不同程度的療效。我們也用fluoxetine(一種SSRI)對SAPAP3突變小鼠進(jìn)行了連續(xù)6天的治療，

6、我們發(fā)現(xiàn)fluoxetine處理可以有效地緩解SAPAP3突變小鼠的過度梳理行為和焦慮水平。 OCD是焦慮類型的神經(jīng)癥，特點(diǎn)是患者具有持續(xù)性的強(qiáng)迫性觀念和強(qiáng)迫性的重復(fù)行為。以前的研究已經(jīng)表明OCD的發(fā)病與皮層-紋狀體-丘腦-皮層環(huán)路的功能缺陷有關(guān)。但是OCD的具體發(fā)病機(jī)制仍是個(gè)謎?？紤]到SAPAP3是SAPAP蛋白家族中唯一在紋狀體中高表達(dá)的成員，SAPAP3突變小鼠是唯一的具有類OCD行為表型的基因敲除小鼠，這強(qiáng)烈提示在SAP

7、AP3突變小鼠中可能有紋狀體突觸功能的缺陷。所以我們做了紋狀體腦片的場電位記錄。我們發(fā)現(xiàn)在SAPAP3突變小鼠中總的場電位降低，但NMDA(N-methyl-D-aspartate)受體介導(dǎo)的場電位卻增高，這說明SAPAP3可以調(diào)節(jié)AMPA(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate)和NMDA這兩種類型的谷氨酸受體的突觸活性，但調(diào)節(jié)的方向相反。我們隨后通過生物化學(xué)的方法研究了SAP

8、AP3突變小鼠的紋狀體的突觸后裝配。結(jié)果顯示SAPAP3突變小鼠的紋狀體的PSD(Post SynapticDensity)中NRl的水平明顯增高，有趣的是，我們也發(fā)現(xiàn)NR2B(非成熟型亞單位)的水平也顯著增高，而NR2A(成熟型亞單位)的水平下降。這提示在SAPAP3突變小鼠中NMDA亞單位的轉(zhuǎn)換沒有發(fā)生，或者轉(zhuǎn)換后NMDA亞單位的構(gòu)成沒能得到維持。結(jié)合電生理學(xué)試驗(yàn)，這些結(jié)果提示SAPAP3在皮層．紋狀體突觸的功能的成熟上起重要作用。

9、另外，通過電子顯微鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)SAPAP3突變小鼠的紋狀體的“致密層”與野生型小鼠的“致密層”相比厚度減少。 由于在SAPAP3突變小鼠中發(fā)現(xiàn)了皮層-紋狀體突觸功能的缺陷和結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)合以前關(guān)于紋狀體環(huán)路在OCD發(fā)病中的作用的理論，我們進(jìn)一步研究了在紋狀體中選擇性表達(dá)SAPAP3是否可以糾正該小鼠的表型，以驗(yàn)證是否SAPAP3的缺失是引起SAPAP3突變小鼠表型的原因。我們將表達(dá)GFP(Greenfluorescence

10、protein)-SAPAP3融合蛋白的lentivirus注射入SAPAP3突變小鼠的雙側(cè)紋狀體中。在注射后4-6月，我們分析了這些小鼠的梳理行為、臉部損傷和焦慮行為。通過連續(xù)的錄像記錄分析，我們發(fā)現(xiàn)GFP-SAPAP3在紋狀體的重新表達(dá)可以緩解SAPAP3突變小鼠的強(qiáng)迫性梳理行為和緩解臉部損傷，并可以減緩焦慮行為。所以，紋狀體中表達(dá)SAPAP3可以糾正SAPAP3突變小鼠的行為表型。然后我們研究了紋狀體切片中的皮層-紋狀體的場興奮性

11、突觸后電位(fieldExcitatory Post Synaptic Potentials，fEPSP)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組(即僅注射GFPlentivirus載體的SAPAP3突變小鼠)相比，紋狀體中GFP-SAPAP3的表達(dá)可以糾正紋狀體的fEPSP。這些結(jié)果支持了關(guān)于SAPAP3在皮層-紋狀體突觸中起作用作用的觀點(diǎn)，同時(shí)也提示了皮層-紋狀體環(huán)路在OCD發(fā)病中的作用，證明了SAPAP3在SAPAP3突變小鼠的類OCD行為的發(fā)病過程

12、中的決定性作用。由于我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈提示SAPAP3介導(dǎo)的皮層．紋狀體-丘腦-皮層環(huán)路在OCD的發(fā)病中扮演重要的角色，我們將用BAC轉(zhuǎn)基因小鼠的方法直接驗(yàn)證這個(gè)想法，在這些轉(zhuǎn)基因小鼠中，SAPAP3的表達(dá)是可以被Cre重組酶調(diào)節(jié)的。如果將時(shí)空可控表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠系與Cre重組酶調(diào)控性SAPAP3表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠交配，在所得的后代中，就可實(shí)現(xiàn)SAPAP3時(shí)空可調(diào)控的表達(dá)。通過將兩側(cè)有Loxp位點(diǎn)的STOP盒放置于SAPAP3 cDNA

13、之前，并加上HA標(biāo)記(也因而命名為HA-SAPAP3STOP)，我們首先成功地制備了這些BAC轉(zhuǎn)基因小鼠，通過將這些小鼠與全基因組表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠交配后，我們用抗-HA染色和western blotting的方法發(fā)現(xiàn)HA-SAPAp3STOP在小鼠表達(dá)情況與野生型小鼠的內(nèi)源的SAPAP3表達(dá)特征基本一致。所以這些HA-SAPAP3STOP將為進(jìn)一步的研究提供很好的實(shí)驗(yàn)工具。 綜上所述，我們的研究證明了SAPAP3在皮層-紋