HCN1通道基因敲除對小鼠膀胱Cajal間質(zhì)細胞中BK通道的表達和功能的影響.pdf

1、目的:
　　膀胱逼尿肌的興奮性異常是臨床上多種疾病如膀胱過度活動癥(OveractiveBladder, OAB)、神經(jīng)源性膀胱等的共同發(fā)病機制之一。闡明膀胱興奮性調(diào)控的機制，對明確這些疾病的發(fā)病機制及臨床診療具有重要意義。目前關(guān)于膀胱興奮性調(diào)控的研究理論主要有神經(jīng)源性和肌源性兩大學(xué)說。膀胱中類似于胃腸道的自身可以起搏并產(chǎn)生興奮的Caja1間質(zhì)細胞（interstitial cells of Caja1，ICCs）發(fā)現(xiàn)以來，肌源性

2、學(xué)說日益得到重視和認可。
　　研究發(fā)現(xiàn)膀胱ICCs上存在著多種離子通道和受體對其興奮性進行調(diào)控，其中可引發(fā)起搏電流的超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道（Hyperpolarization-ActivatedCyclic Nucleotide-Gated Channels，HCN Channels）即HCN通道的發(fā)現(xiàn)，為ICCs作為興奮起搏細胞的理論提供了可能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。M受體（Muscarinic Receptors）、P2X3受體

3、（Purinergic P2X3 Receptors，P2X3 Receptors）等神經(jīng)受體可接受來自神經(jīng)的信號，參與ICCs興奮性的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)機械牽張也可調(diào)控ICCs的興奮性。此外，研究證實，在膀胱逼尿肌細胞之間、ICCs與逼尿肌細胞之間存在存在著細胞間通訊。以上研究說明ICCs極有可能是膀胱自身源性的興奮性調(diào)控機制的樞紐，它整合并傳遞來自神經(jīng)、牽張刺激等調(diào)控信號，發(fā)起HCN通道起源的起搏電流信號，并通過多種離子通道、受體和細胞

4、間通訊將興奮傳遞至逼尿肌。這其中，HCN通道是核心，而與鈣離子相關(guān)的多種離子通道參與并扮演了重要角色。
　　HCN通道被普遍認為是起搏電流發(fā)起通道，其不同亞型在心臟起搏和神經(jīng)節(jié)律調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，人類和大鼠膀胱ICCs上都存在HCN通道并記錄到其起搏電流If，且鼠類表達以HCN1通道為主。在大鼠逼尿肌過度活動(DetrusorOveractivity, DO)時，HCN通道的表達及功能升高。在膀胱中，HCN通道很可能擔(dān)

5、任興奮起搏的角色，且與DO的形成有關(guān)。在與鈣離子相關(guān)的離子通道中，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道即BK通道（Large-Conductance Calcium-Activated Potassium Channels，BKChannels）本身對鈣離子沒有通透性，它引發(fā)的鉀外流可負反饋性地抑制鈣內(nèi)流。在平滑肌細胞中，BK通道的激活可限制去極化，抑制收縮，調(diào)節(jié)平滑肌使其舒張。研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)BK通道可影響膀胱興奮性，其上調(diào)或下調(diào)均可導(dǎo)致不同類型的膀胱功能

6、障礙。膀胱ICCs中也有BK通道的表達，在DO時，其表達及功能降低。BK通道參與了膀胱ICCs的興奮性調(diào)控，且與DO的形成有關(guān)。
　　HCN通道和BK通道存在著可能的順承關(guān)系，兩者都對ICCs興奮性的調(diào)節(jié)起著重要作用，干預(yù)HCN通道后BK通道的生理學(xué)改變是我們關(guān)注的內(nèi)容。HCN1通道是鼠類膀胱中主要的HCN通道亞型，本文旨在研究HCN1通道基因敲除對小鼠膀胱ICCs中BK通道的表達和功能的影響，并初步探討這種影響對膀胱興奮性調(diào)控的

7、意義。
　　方法：
　　1.本研究采用HCN1通道基因敲除(HCN1 knockout，HCN1 KO) C57BL/6J小鼠和HCN1通道野生型(HCN1 wide type，HCN1 WT) C57BL/6J小鼠作為實驗對象，分別記為敲基因組和正常組。
　　2.表達檢測:通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、熒光定量PCR(Q-PCR)實驗在mRNA水平檢測敲基因小鼠膀胱中BK通道各亞基的表達變化;通過Western

8、blot(WB)實驗在蛋白水平檢測敲基因小鼠膀胱中BK通道各亞基的表達變化;急性酶分離法分離培養(yǎng)膀胱原代ICCs，通過免疫熒光雙標實驗進一步檢測敲基因小鼠膀胱ICCs中BK-α亞基的表達變化。
　　3.功能檢測:通過離體逼尿肌肌條實驗比較敲基因組和正常組小鼠肌條的收縮功能，然后檢測加入IBTX后小鼠肌條的收縮變化，比較敲基因組和正常組肌條收縮變化對IBTX的敏感程度以評價二者膀胱中BK通道的功能變化;急性酶分離法分離培養(yǎng)膀胱原代I

9、CCs，通過激光共聚焦顯微鏡下ICCs內(nèi)鈣離子熒光采集實驗檢測分別加入NS1619和IBTX后鈣熒光的變化，比較敲基因組和正常組ICCs內(nèi)鈣熒光對NS1619、IBTX的敏感程度以評價二者ICCs中BK通道的功能變化。
　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR、Q-PCR實驗結(jié)果顯示敲基因組小鼠膀胱中BK通道的α、β1、β2、β3、β4亞基表達均顯著低于正常組(P＜0.01);
　　2.WB實驗結(jié)果顯示敲基因組小鼠膀胱中BK通

10、道的α、β1、β2、β3、β4亞基表達均顯著低于正常組（α、β3、β4:P＜0.01;β1、β2: P＜0.05）;
　　3.急性酶分離法分離后培養(yǎng)，得到活性良好的膀胱原代ICCs;
　　4.免疫熒光雙標實驗結(jié)果顯示敲基因組小鼠膀胱ICCs中BK-α亞基表達顯著低于正常組(P＜0.01);
　　5.離體逼尿肌肌條實驗結(jié)果顯示，未添加藥物條件下，敲基因組小鼠肌條收縮幅度和頻率均顯著低于正常組(P＜0.05，P＜0.01)

11、，加入IBTX后，敲基因組和正常組肌條收縮幅度均變大（P＜0.01，P＜0.05），頻率則沒有明顯變化(P＞0.05)，且敲基因組肌條收縮幅度的變化值顯著低于正常組(P＜0.05);
　　6.鈣熒光采集實驗結(jié)果顯示，加入NS1619后，敲基因組、正常組ICCs內(nèi)鈣熒光均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，加入IBTX后，敲基因組、正常組ICCs內(nèi)鈣熒光均顯著增高(P＜0.01)。且不論加入NS1619或IBTX，比較加藥前后I