小鼠心房細(xì)胞RyR2鈣釋放通道對SD2通道的影響.pdf

1、研究背景及目的：
　　 生物膜離子通道(ion channels of biomembrane)是各種離子跨膜運(yùn)輸?shù)耐?它是由細(xì)胞產(chǎn)生的特殊蛋白質(zhì)構(gòu)成。生物膜對離子的通透性與多種生命活動過程密切相關(guān),例如,感受器電位的發(fā)生、神經(jīng)興奮與傳導(dǎo)、各種反射活動以及心臟搏動、平滑肌蠕動、骨骼肌收縮、激素分泌等。細(xì)胞膜離子通道有多種,如鉀通道、鈉通道、鈣通道、氯通道、乙酰膽堿依賴性通道等等,其中的鉀通道又包括多種:延遲整流鉀通道(dela

2、yed rectifying potassium),鈣激活鉀通道(Calcium-activated potassium channal),內(nèi)向整流的鉀通道(inwardly rectifyingpotassium)。本文研究的小電導(dǎo)鈣激活鉀通道(Small-conductanceCalcium-activated potassium channal)是鈣激活鉀通道的一種,在可興奮細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用,其中SK2對蜂毒明肽(apamin

3、)比其他三種亞型敏感,具有K+選擇性,Ca2+高度敏感性和電壓非依賴性等特征。SK2通道分布廣泛,如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、平滑肌、人和小鼠的心肌等組織,在心肌中心房肌的表達(dá)高于心室肌。
　　 心肌細(xì)胞SK2通道作為鈣激活的鉀通道對胞漿中的鈣離子具有高度敏感性,細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高時(shí),SK2通道激活,K+外流,參與動作電位復(fù)極化的完成,由此可見細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號對通道的激活至關(guān)重要。細(xì)胞內(nèi)Ca2+來源主要由兩條途徑獲得:細(xì)胞膜電壓門控

4、Ca2+通道(Voltage-gated Ca2+channels,VGCCs)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ryanodine受體(ryanodine receptors,RyRs),后者是存在于真核生物細(xì)胞肌漿網(wǎng)(Sarcoplasm icreticμlum,SR)上的一種細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放通道。哺乳類動物組織中已鑒定出RyRs的3種亞型,分別是RyR1(ryanodinereceptor type1),RyR2(ryanodine recepto

5、r type2)和RyR3(ryanodine receptor type3)。RyR2主要存在于心肌細(xì)胞,位于細(xì)胞的SR。RyRs是細(xì)胞內(nèi)最為主要的Ca2+釋放通道,通過釋放SR內(nèi)的Ca2+來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度。其主要作用機(jī)制是鈣離子誘導(dǎo)的鈣釋放(Ca2+induced Ca2+release,CICR),當(dāng)心肌細(xì)胞去極化時(shí),細(xì)胞膜上的L型Ca2+通道(L-Calcium channels,LCCs)開放,少量的Ca2+內(nèi)流,使

6、胞漿中Ca2+濃度單位時(shí)間內(nèi)迅速升高,Ca2+與SR上的雷尼丁受體(ryanodinereceptor2,RyR2)結(jié)合并使其開放,導(dǎo)致大量的Ca2+從SR中釋放入胞漿,此過程即為鈣誘導(dǎo)的鈣釋放(Ca2+-induced Ca2+release,CICR)。它為骨骼肌和心肌收縮提供肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+,直接參與心肌的興奮-收縮耦聯(lián)過程,RyR2的激活可使細(xì)胞內(nèi)鈣離子迅速增加,其Ca2+濃度可快速增高至10倍以上。
　　 已有工作表明心

7、肌細(xì)胞L-型Ca2+通道與SK2通道具有功能性耦聯(lián)[4]。RyRs-Ca2+釋放通道,SK2通道及電壓-門控Ca2+通道在功能上與細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號密切相關(guān)。心房細(xì)胞中RyRs-Ca2+釋放通道是否影響SK2通道的功能?國內(nèi)外尚未見報(bào)道。此外,心房細(xì)胞SK通道的分子的調(diào)控途徑也尚未明確。本研究對RyRs-Ca2+釋放通道是否影響心房細(xì)胞SK2通道進(jìn)行了初步探討,為進(jìn)一步探討SK2通道的電生理功能及其與心律失常發(fā)生機(jī)制關(guān)系的研究奠定堅(jiān)實(shí)的

8、理論基礎(chǔ),為臨床治療房性心律失常提供新思路。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動物:健康的成年(16—22W)C57BL／6J小鼠,體重20-25g,雌雄不拘,購于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。
　　 2.急性分離小鼠心房細(xì)胞:將小鼠麻醉,打開胸腔行主動脈插管,主動脈根部逆行插管成功后置于Langendorff裝置上進(jìn)行恒溫恒速灌流。灌流液分別為無鈣臺氏液,酶消化液和高鉀液,酶消化液由Ⅱ型膠原酶、蛋白酶、氯化鈣和牛血清白蛋白

9、溶于無鈣臺氏液中所得。急性分離小鼠心臟得到單個(gè)心房細(xì)胞。
　　 3.應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄不同藥物作用于細(xì)胞時(shí)SK2通道在不同電壓(-120～60mV)下的電流變化。
　　 4.統(tǒng)計(jì)處理:所有數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,使用pulse8.67軟件記錄和分析通道電流,采用Origin6.0來制圖,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS13.0軟件,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用單因素方差分析法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.急

10、性分離心房細(xì)胞時(shí)得到邊緣清晰的梭形細(xì)胞。
　　 2.從電流密度-電壓曲線上可以看出通道電流隨著電壓升高反而降低,與時(shí)間無關(guān),具有內(nèi)向整流的特征,反轉(zhuǎn)電位約-73mV,符合Nernst方程。
　　 3.SK2通道電流可以被apamin阻斷。加入激動劑咖啡因可以使SK2通道電流增大,而加入抑制劑Ryanodine和Thapsigargin可以使SK2通道電流明顯降低,在部分電壓下經(jīng)檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明改變RyR2通道狀態(tài)