RyR2-PBmice鑒定及RyR2基因轉(zhuǎn)座子插入突變對(duì)小鼠心臟和胰臟功能的影響.pdf

1、蘭尼堿受體(Ryanodine receptors，RyRs)是位于細(xì)胞肌漿網(wǎng)(Sarcoplasmic reticulum，SR)上的鈣釋放通道，由四個(gè)亞基組成，分子量約565 KD。根據(jù)編碼基因的不同可分為RyR1、RyR2和RyR3三個(gè)亞型，其中RyR2主要分布于心臟組織，通過Ca2+誘導(dǎo)的Ca2+釋放(Ca2+ induced Ca2+ release，CICR)機(jī)制參與心臟的興奮收縮偶聯(lián)。RyR2對(duì)心臟維持正常的生理活動(dòng)至關(guān)重

2、要，其功能異常會(huì)引起Ca2+調(diào)節(jié)紊亂而導(dǎo)致心律失常、心力衰竭等多種心臟疾病。
　　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可以為發(fā)現(xiàn)和評(píng)價(jià)人類疾病提供有利的工具，小鼠與人的基因組相似程度高，繁殖周期短，是最常用的模式動(dòng)物。在小鼠體內(nèi)通過轉(zhuǎn)基因、基因誘變等改變相關(guān)功能基因的序列和結(jié)構(gòu)，可以用來制備人類疾病的動(dòng)物模型，探索疾病發(fā)生的機(jī)制，開發(fā)疾病相關(guān)的治療藥物等。轉(zhuǎn)座子是基因組中一段可移動(dòng)的DNA序列，可作為一種轉(zhuǎn)基因載體廣泛應(yīng)用于基因功能研究中。piggyB

3、ac(PB)轉(zhuǎn)座子是近年來發(fā)現(xiàn)的可在小鼠體內(nèi)高效轉(zhuǎn)座的哺乳動(dòng)物基因工程工具，具有轉(zhuǎn)座活性高、負(fù)載容量大、切除后無痕和長(zhǎng)期穩(wěn)定遺傳等多種優(yōu)勢(shì)，基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)培育出基因突變的轉(zhuǎn)座鼠(PBmice)。作為體內(nèi)重要的細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放通道，本研究我們將采用復(fù)旦大學(xué)成功構(gòu)建的PBmice，探討PB插入突變對(duì)RyR2自身功能以及小鼠體內(nèi)生物學(xué)特性的影響。
　　本課題第一部分，我們首先從復(fù)旦大學(xué)PB突變信息數(shù)據(jù)庫(P

4、iggyBac MutagenesisInformation Center，http://idm.fudan.edu.cn/PBmice/)中篩選并引進(jìn)了piggyBac轉(zhuǎn)座RyR2基因雜合小鼠(RyR2-PBmice)。轉(zhuǎn)座子插入突變小鼠表現(xiàn)為純合子宮內(nèi)死亡而雜合子生長(zhǎng)狀態(tài)良好，說明PB轉(zhuǎn)座子的插入可以引起RyP2基因功能丟失或異常，同時(shí)也反映了RyR2基因功能對(duì)小鼠生命過程維持的重要性。通過轉(zhuǎn)座元件攜帶的紅色熒光蛋白(RedFluo

5、resent Protein，RFP)追蹤和PCR測(cè)定，我們成功鑒定了RyR2-PBmice。通過對(duì)小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)該RyR2-PBmice可穩(wěn)定遺傳，其外觀表型與野生型小鼠(WTmice)并無明顯差別。由于PB轉(zhuǎn)座元件中帶有RFP的融合序列，因此我們采用激光掃描共聚焦顯微鏡一方面檢測(cè)RFP分布，同時(shí)利用免疫熒光技術(shù)監(jiān)測(cè)RyR2在體內(nèi)的分布情況。研究發(fā)現(xiàn)RyR2主要表達(dá)于心臟、骨骼肌、平滑肌和腦組織中，RFP與RyR2的表達(dá)分布

6、基本一致。與WTmice相比，RyR2-PBmice中RyR2的表達(dá)水平未見明顯的差異。為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)座后RyR2的表達(dá)變化，我們對(duì)RyR2-PBmice和WTmice心臟組織進(jìn)行了RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)分別從mRNA和蛋白水平進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RyR2-PBmice心臟組織中RyR2的mRNA水平比WTmice顯著降低，但Western Blot研究表明RyR2的表達(dá)量與野生小鼠相比未見顯著性差異。說明RyR2-

7、PBmice通過轉(zhuǎn)錄后修飾維持了與WTmice相當(dāng)?shù)腞yR2表達(dá)水平，這可能是RyR2-PBmice可以維持正常心臟興奮收縮偶聯(lián)以及正常生長(zhǎng)狀態(tài)的重要原因。
　　RyR2作為心肌細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)Ca2+釋放通道，是維系心肌細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)與心臟正常興奮收縮偶聯(lián)過程，以及心臟正常收縮與舒張功能的關(guān)鍵蛋白。因此，在本課題的第二部分研究中，我們首先研究了piggyBac轉(zhuǎn)座插入RyR2基因?qū)yR2-PBmice心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響。異氟醚

8、麻醉下監(jiān)測(cè)RyR2-PBmice和WTmice心電圖發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)狀態(tài)和注射腎上腺素和咖啡因狀態(tài)下，兩組小鼠的心電圖沒有明顯差異，說明RyR2-PBmice并不會(huì)影響到小鼠在基礎(chǔ)和應(yīng)激狀態(tài)下的心臟功能。進(jìn)一步通過激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定咖啡因刺激后小鼠心肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)Ca2+容量，發(fā)現(xiàn)RyR2-PBmice心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+容量明顯減小，這提示RyR2-PBmice對(duì)心肌細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)仍然存在一定的影響。組織病理學(xué)和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)R

9、yR2-PBmice心肌組織內(nèi)線粒體嵴大量斷裂、溶解，并且線粒體膜結(jié)構(gòu)不完整。線粒體功能研究則發(fā)現(xiàn)RyR2-PBmice心肌線粒體膜電位下降，ATP含量明顯降低。這些結(jié)果提示piggyBac轉(zhuǎn)座插入RyR2基因嚴(yán)重影響了小鼠心肌線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致能量代謝障礙。為進(jìn)一步分析iggyBac轉(zhuǎn)座插入PyR2基因?qū)π∈笮呐K，尤其是心臟線粒體結(jié)構(gòu)和功能影響的作用機(jī)制，我們對(duì)比研究了RyR2-PBmice和WTmice兩組小鼠心臟組織的轉(zhuǎn)錄組

10、學(xué)并篩選出部分與RyR2以及線粒體功能密切相關(guān)的信號(hào)通路差異蛋白，并利用RT-PCR和Western Blot進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)PKA激活RyR2的小G蛋白，線粒體編碼的細(xì)胞色素C氧化酶，線粒體呼吸鏈相關(guān)的解耦聯(lián)蛋白UCP以及線粒體鈣攝取蛋白均出現(xiàn)明顯下調(diào)，進(jìn)一步說明了piggyBac轉(zhuǎn)座插入RyR2基因?qū)π∈笮呐KRyR2功能以及心肌細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)功能具有顯著的影響。
　　引入注意的是，我們?cè)赗yR2-PBm

11、ice活檢時(shí)發(fā)現(xiàn)其胰臟組織呈現(xiàn)比其他所有臟器都要明顯的粉紅色，并且與周圍組織的界限非常明顯。結(jié)合RyR2在胰島素分泌和葡萄糖體內(nèi)平衡方面發(fā)揮重要作用的文獻(xiàn)報(bào)道，我們?cè)诘谌糠轴槍?duì)RyR2-PBmice胰臟結(jié)構(gòu)與功能的影響進(jìn)行了專門研究。我們認(rèn)為，RyR2-PBmice胰臟紅色顆粒物沉著可能是piggyBac轉(zhuǎn)座子攜帶的紅色熒光蛋白富集所致。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，胰臟中線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，與心肌線粒體結(jié)構(gòu)變化類似。胰臟功能研究方面，我

12、們對(duì)比進(jìn)行了RyR2-PBmice和WTmice的葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)條件下兩組小鼠血清葡萄糖濃度和胰島素水平接近;當(dāng)葡萄糖刺激后，RyR2-PBmice葡萄糖和胰島素濃度與WTmice相比均出現(xiàn)顯著性差異，說明RyR2-PBmice的胰島耐受能力受到明顯損害。免疫印跡結(jié)果表明RyR2-PBmice胰臟組織中線粒體呼吸功能相關(guān)蛋白如細(xì)胞色素C氧化酶、解耦聯(lián)蛋白UCP表達(dá)量顯著下降，而直接參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT-4

13、與WTmice中表達(dá)量接近。提示piggyBac轉(zhuǎn)座插入RyR2基因不直接影響胰臟組織的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，而是通過影響線粒體呼吸鏈導(dǎo)致能量代謝障礙，從而影響胰臟組織的胰島素分泌和體內(nèi)葡萄糖代謝調(diào)節(jié)的過程。
　　總之，通過攜帶有RFP的piggyBac轉(zhuǎn)座子插入RyR2基因成功建立了雜合小鼠RyR2-PBmice的動(dòng)物模型。雖然沒有發(fā)現(xiàn)RyR2-PBmice存在心臟功能異常表現(xiàn)，但仍然發(fā)現(xiàn)其心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+容量下降，線粒體結(jié)構(gòu)異常，