草魚肌肉生長(zhǎng)抑制素2的克隆、功能分析以及Tgf2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的魚類插入誘變研究.pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國(guó)四大家魚之一,年產(chǎn)量接近400萬(wàn)噸,其研究很受重視。而草魚肌肉作為草魚的主要食用部位,其生長(zhǎng)和發(fā)育調(diào)控的研究逐漸成為研究的熱點(diǎn)。myostatin基因編碼 MSTN蛋白,是高等脊椎動(dòng)物(如小鼠和畜禽)肌肉生長(zhǎng)的關(guān)鍵性負(fù)性調(diào)控因子,該基因?qū)ν瑢偌棺祫?dòng)物的硬骨魚類肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育也可能扮演著重要的作用。在高等脊椎動(dòng)物中只發(fā)現(xiàn)存在1個(gè) MSTN基因即 mstn1,而在有些魚類中不僅存

2、在 mstn1,還存在第2個(gè) mstn2基因。在草魚中,是否存在 mstn2基因及其在草魚肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能目前尚不清楚。
　　本研究在草魚中克隆到了 MSTN2 cDNA,全長(zhǎng)為1976bp,可編碼364個(gè)氨基酸。胚胎不同時(shí)期的RT-PCR結(jié)果顯示,MSTN2 mRNA在草魚胚胎發(fā)育各階段均有表達(dá),但早期表達(dá)量較低,中后期表達(dá)量逐步升高。在草魚早期胚胎的原位雜交中沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào),而在草魚胚胎發(fā)育的中期,腦和脊索中可檢測(cè)到微

3、弱表達(dá),在后期胚胎中表達(dá)信號(hào)增強(qiáng)。RT-PCR結(jié)果顯示,MSTN2 mRNA在草魚腦、肌肉、性腺、肝臟和眼中均有表達(dá),其中在腦中表達(dá)量較高,而在其它組織中則沒(méi)有表達(dá)。在受精卵中顯微注射 MSTN2的5’加帽 mRNA對(duì)草魚胚胎的早期發(fā)育影響不大,但后期草魚胚胎體形扭曲、尾巴彎曲,并呈現(xiàn)出明顯的畸形;對(duì)過(guò)表達(dá)36h后的草魚胚胎用肌肉發(fā)育相關(guān)的myoD,myoG,ntl探針進(jìn)行原位雜交,發(fā)現(xiàn) MSTN2的增加可造成草魚肌節(jié)扭曲膨大、體軸彎曲

4、及肌肉發(fā)育障礙。這些結(jié)果表明,與 MSTN1基因類似,草魚 MSTN2對(duì)草魚的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育也起著重要的調(diào)控作用?；贛STNs對(duì)草魚肌肉生長(zhǎng)起著明顯的抑制作用,本研究還進(jìn)一步開(kāi)展了 MSTN1基因反義 mRNA敲降的初步研究。利用我們自主開(kāi)發(fā)的鯉科魚類 Tgf2轉(zhuǎn)座子,構(gòu)建了 MSTN1的反義敲降載體—pTgf2-EF1α-antimstn1,通過(guò)與編碼轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒共同顯微注射到草魚、鯽魚和團(tuán)頭魴的受精卵(1-2細(xì)胞期)中,以獲得反

5、義 mstn1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因后代,從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性 mstn1基因的敲降。初步的研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)反義 mstn1的陽(yáng)性魚比非轉(zhuǎn)基因的陰性魚體重增加顯著(P<0.05),表明了草魚 mstn基因在草魚肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的負(fù)調(diào)控作用。
　　本文還開(kāi)展了 Tgf2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的魚類插入誘變研究。以 Tgf2轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ),分別構(gòu)建了帶有4種不同啟動(dòng)子的供體質(zhì)粒——pTgf2-EF1α-eGFP、pTgf2-Krt8-eGFP、pTgf2-βacti

6、n-eGFP和pTgf2-MyoD-eGFP,以及輔助質(zhì)粒 pCS2-β-actin-gfTP,將供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座酶 mRNA共同注射到草魚、鯽和團(tuán)頭魴的受精卵中,初步建立了一個(gè)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入誘變庫(kù)。研究結(jié)果顯示,在鯽和團(tuán)頭魴的早期胚胎中,熒光率達(dá)到90％,在草魚中則達(dá)到95%。隨著注射的供體質(zhì)粒的不同,表現(xiàn)出不同的熒光特征——肌肉熒光、表皮熒光及全身熒光,eGFP在平游期的整合率平均為53%,在1齡階段的整合率在35%左右。