轉(zhuǎn)座子PgPLE1種群插入多態(tài)性研究.pdf

1、棉紅鈴蟲(chóng)是重要的棉花害蟲(chóng)，在全世界許多國(guó)家和地區(qū)都有危害報(bào)道。利用粉紋夜蛾piggyBac作為載體的轉(zhuǎn)基因(EGFP，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)棉紅鈴蟲(chóng)已獲得成功，并且成為目前唯一獲準(zhǔn)登記用于田間釋放試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。piggyBac是一種從粉紋夜蛾中分離到的、具有TTAA插入位點(diǎn)特異性的DNA轉(zhuǎn)座子。piggyBac可在昆蟲(chóng)基因組中準(zhǔn)確切離，轉(zhuǎn)化頻率較高，并且不受宿主因子的限制，是目前轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)研究中最有應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)座子載體。本文分析了

2、piggyBac類轉(zhuǎn)座子PgPLE1在棉紅鈴蟲(chóng)基因組中的插入特性、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座活性及種群插入多態(tài)性，并結(jié)合線粒體DNA COI分子標(biāo)記分析了棉紅鈴蟲(chóng)種群遺傳變異。 應(yīng)用vectorette PCR獲得了棉紅鈴蟲(chóng)piggyBac轉(zhuǎn)座子PgPLE18個(gè)插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，并在此基礎(chǔ)上對(duì)PgPLE1基因組插入特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，PgPLE1大多數(shù)拷貝在基因組中特異性插入TTAA靶標(biāo)位點(diǎn)，6個(gè)拷貝插入基因非編碼區(qū)，一個(gè)拷貝插入?yún)^(qū)域與黑

3、腹果蠅反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tirant的gag蛋白同源性為30％，另一個(gè)拷貝插入?yún)^(qū)域與家蠶非LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的反轉(zhuǎn)錄酶同源性為53％。 通過(guò)RT-PCR和vectorette PCR分析了轉(zhuǎn)座子PgPLE1的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座活性。以棉紅鈴蟲(chóng)cDNA為模板的RT-PCR檢測(cè)到PgPLE13種不同大小的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，克隆和測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其中一個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼完整的轉(zhuǎn)座酶。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)以棉紅鈴蟲(chóng)父代與F1子代個(gè)體基因組DNA為模板的3，vector

4、ette PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，PgPLE1在F1子代兩個(gè)個(gè)體的基因組插入位點(diǎn)發(fā)生變化，表明PgPLE1具有轉(zhuǎn)座活性。 通過(guò)PCR檢測(cè)了PgPLE1在江蘇句容、湖北仙桃、湖南安鄉(xiāng)和岳陽(yáng)以及美國(guó)亞利桑那等5個(gè)棉紅鈴蟲(chóng)地理種群中的插入多態(tài)性，并在此基礎(chǔ)上分析了宿主種群遺傳關(guān)系。PgPLE1的5個(gè)插入位點(diǎn)在各種群中的基因型分布大都符合Hardy-Weinberg平衡，各插入位點(diǎn)的平均基因頻率介于0.0050～0.2400之間。

5、以各種群基因頻率為基礎(chǔ)，對(duì)棉紅鈴蟲(chóng)5個(gè)地理種群間的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)生分析表明，棉紅鈴蟲(chóng)種群間遺傳關(guān)系與地理分布基本一致，表明轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)性可用于昆蟲(chóng)種群遺傳分化研究。 對(duì)江蘇句容、湖北洪湖和仙桃、湖南安鄉(xiāng)和岳陽(yáng)以及美國(guó)亞利桑那等6個(gè)棉紅鈴蟲(chóng)地理種群40個(gè)個(gè)體的線粒體DNA CO I基因部分序列進(jìn)行了測(cè)定和分析。在獲得的760bp序列中，共鑒定了5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)和6種單倍型，其中獨(dú)享單倍型有4個(gè)，表明這些地理種群之間已出現(xiàn)一定程度