細(xì)胞膜磷脂PIP-,2-水解、細(xì)胞內(nèi)鈣釋放與M通道功能關(guān)系的研究.pdf

1、磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)廣泛存在于各種真核細(xì)胞的胞膜中，并主要分布于細(xì)胞膜靠近胞漿的內(nèi)側(cè)面。PIP2雖然占細(xì)胞膜質(zhì)脂的含量很少(不到1％)，但卻作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，在包括產(chǎn)生胞內(nèi)第二信使、胞吐與胞飲調(diào)控、細(xì)胞骨架與胞膜貼附等一系列細(xì)胞的生理過程及生命活動中發(fā)揮著重要作用。 PIP2是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，經(jīng)磷脂酶C(PLC)水解后可生成DAG及IP3，二者可作為第二信使，分別激活PKC與促

2、使細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋鈣。目前越來越多的證據(jù)表明，PIP2雖為信號通路中的上游分子，其本身亦作為一種重要調(diào)節(jié)因子，參與了包括N型鈣通道、多種電壓依賴性鉀通道(Kir，KCNQ等)的功能調(diào)控。 M通道電流作為一種慢激活、非失活的電壓依賴型外向鉀離子電流，因其可被毒蕈堿受體(M受體)激活后所抑制，所以由此而得名。在Brown和Adams首次在牛蛙頸上交感神經(jīng)節(jié)發(fā)現(xiàn)M電流后的近25年的時間里，人們對其調(diào)節(jié)機(jī)制作了大量研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多與Gq蛋

3、白偶聯(lián)的受體激活后能引起M電流的抑制，信號通路的許多下游分子，包括PKC、AKAP150、CaM、鈣離子、花生四烯酸及代謝產(chǎn)物等均被證實參與了受體介導(dǎo)的M電流抑制過程，但是其確切的調(diào)節(jié)機(jī)制還是不得而知。M電流的抑制將導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)興奮性升高。而M通道功能失調(diào)與良性家族性新生兒驚厥癥(BFNCs)、阿爾茨海默氏病(Alzheimer)、癲癇等疾病有密切關(guān)系。最近的研究表明，PIP2本身可以直接激活M電流，而其水解則是受體介導(dǎo)的M電流抑制的原

4、因之一。PIP2水解后所引發(fā)鈣離子釋放則被證實在某些受體發(fā)揮對M電流的調(diào)節(jié)中必不可少。 本實驗將以爪蟾卵母細(xì)胞、HEK293細(xì)胞及幾種類型神經(jīng)元為研究對象，觀察不同Gq蛋白偶聯(lián)受體激活后引起的PIP2水解與內(nèi)鈣釋放關(guān)系，進(jìn)而研究這兩種因素在M通道調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮的作用。 一、在表達(dá)系統(tǒng)中觀察細(xì)胞膜磷脂PIP2水解與細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的關(guān)系 目的：研究卵母細(xì)胞中外源性表達(dá)的M1受體及BK2受體激活后究竟是否引發(fā)細(xì)胞膜PIP

5、2水解與胞內(nèi)鈣升高，并探討二者關(guān)系。此外，利用另一表達(dá)系統(tǒng)-HEK293細(xì)胞，繼續(xù)探討上述過程的機(jī)制。 結(jié)論：(1)M1受體、BK2受體激活后可誘導(dǎo)出卵母細(xì)胞自身表達(dá)的鈣激活氯通道電流，提示細(xì)胞內(nèi)鈣有升高，且這種內(nèi)鈣升高絕大部分來自于卵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫鈣釋放。(2)可以利用激光掃描共聚焦顯微鏡對卵母細(xì)胞內(nèi)鈣升高進(jìn)行觀察。M1受體、BK2受體激活后均引起鈣波在胞內(nèi)的擴(kuò)布。(3)表達(dá)于卵母細(xì)胞的M1受體激活后，可引發(fā)卵母細(xì)胞膜的PI

6、P2水解。PIP2水解與內(nèi)鈣釋放的發(fā)生在時間上密切相關(guān)。(4)HEK293細(xì)胞所表達(dá)的M1受體、BK2受體激活后均可引起細(xì)胞膜PIP2水解與內(nèi)鈣升高，且二者的發(fā)生在時間上密切相關(guān)。 二、幾種Gq蛋白偶聯(lián)受體激動劑引發(fā)不同神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放作用的研究 目的：比較Gq蛋白相偶聯(lián)的M1，H1，angiotensinⅡ，BK2，P2Y受體激活后引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的作用。 結(jié)論：Oxo-M，bradykinin，angio

7、tensinⅡ，histamine，激活同種神經(jīng)細(xì)胞中Gq蛋白偶聯(lián)的相應(yīng)受體后，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的作用之間存在著明顯不同，而且相同受體在不同類型神經(jīng)細(xì)胞中被激活后也會產(chǎn)生不同現(xiàn)象。鈣離子作為一種重要的第二信使參與細(xì)胞的許多調(diào)節(jié)過程，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的不同變化，必然導(dǎo)致下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的不同。這將對解釋神經(jīng)遞質(zhì)與激素作用的多樣性具有重要意義。 三、組胺(histamine)對大鼠頸上神經(jīng)節(jié)M電流的調(diào)節(jié)目的：研究組胺對原代細(xì)胞M通道電流

8、的調(diào)節(jié)機(jī)制，探討其調(diào)節(jié)作用與胞內(nèi)鈣釋放的內(nèi)在關(guān)系。 方法：(1)采用全細(xì)胞膜片鉗記錄法，觀察組胺對大鼠SCG表達(dá)的M電流作用。(2)采用LSCM方法，觀察組胺引發(fā)大鼠SCG細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的作用。 總結(jié) 1.表達(dá)于卵母細(xì)胞及HEK293細(xì)胞上的M1與BK2受體激活后，均能引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高，生高的鈣離子主要來自內(nèi)鈣的釋放。HEK293細(xì)胞M1與BK2受體激動后，引起胞膜PIP2水解，PIP2水解與內(nèi)鈣釋放在時程上一致。

9、卵母細(xì)胞M1受體激動后，亦引起胞膜PIP2水解。 2.同為Gq蛋白偶聯(lián)的不同受體激動后，在同一神經(jīng)細(xì)胞中引發(fā)的鈣信號存在不同；而在不同類型神經(jīng)細(xì)胞間，同一Gq蛋白偶聯(lián)受體激活也能引發(fā)不同的鈣信號。 3.組胺在其生理濃度10μM對大鼠SCG細(xì)胞的M電流產(chǎn)生抑制，這種抑制作用是通過激動H1受體，進(jìn)而激活磷脂酶(PLCβ)引起的。組胺可以引發(fā)SCG細(xì)胞內(nèi)鈣釋放，并伴隨大量外鈣內(nèi)流。但組胺的抑制作用并不受內(nèi)鈣螯和的影響。組胺對M