體外培養(yǎng)小鼠小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞及SCL轉(zhuǎn)基因?qū)ζ浔磉_(dá)c-kit的影響.pdf

1、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)是胃腸慢波的起搏細(xì)胞(pacemakercells)[1-4]。ICC缺失與糖尿病性胃腸動(dòng)力紊亂、慢傳輸性便秘、慢性假性腸梗阻等眾多胃腸動(dòng)力紊亂性疾病密切相關(guān)[5，6]。酪氨酸激酶受體c-kit是胃腸道ICC的特異性標(biāo)志，干細(xì)胞因子(stemcellfactor，SCF)與c-kit結(jié)合后所啟動(dòng)的信號(hào)通路，對(duì)ICC發(fā)育、分化及表型維持穩(wěn)定至關(guān)重要[8-10]。多種外源性因素均可通過(guò)下調(diào)c-kit表達(dá)使ICC失

2、去正常的表型特征，如對(duì)c-kit反應(yīng)呈陰性，而對(duì)部分平滑肌抗原反應(yīng)呈陽(yáng)性，細(xì)胞突起變短或消失，ICC數(shù)目減少并直接導(dǎo)致胃腸道平滑肌慢波喪失，但并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡或壞死[6，11，12]。如何使發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的ICC通過(guò)重建c-kit信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)表型逆轉(zhuǎn)，是醫(yī)學(xué)工作者面臨的一個(gè)難題。 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，c-kit轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)存在核轉(zhuǎn)錄因子SCL結(jié)合位點(diǎn)，SCL主要是通過(guò)作用于c-kit基因啟動(dòng)子調(diào)節(jié)c-kit表達(dá)來(lái)發(fā)揮其“生存基因”的功能，

3、其對(duì)SCF依賴(lài)型細(xì)胞以及CD34(CD34+)陽(yáng)性細(xì)胞的生存具有重要的調(diào)控作用，可強(qiáng)烈上調(diào)造血細(xì)胞、多種干細(xì)胞以及其他多種CD34+細(xì)胞表達(dá)c-kit[4，13-15]，CD34+的TL-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染反義SCLcDNA后c-kit表達(dá)明顯降低，并對(duì)SCF失去反應(yīng)性，而SCL過(guò)表達(dá)則可使c-kit表達(dá)升高并對(duì)SCF反應(yīng)性恢復(fù)正常，可見(jiàn)SCL在c-kit表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[35-37]。ICC是SCF依賴(lài)型且CD34+的細(xì)胞，但目前尚無(wú)有

4、關(guān)SCL對(duì)ICC表達(dá)c-kit調(diào)控作用的報(bào)道。我們由此設(shè)想，通過(guò)上調(diào)體外培養(yǎng)ICC內(nèi)SCL表達(dá)和活性水平，達(dá)到促進(jìn)ICC表達(dá)c-kit的目的，從而為通過(guò)重建c-kit信號(hào)通路促進(jìn)表型受損ICC恢復(fù)表型奠定基礎(chǔ)。 體外培養(yǎng)ICC方法是研究細(xì)胞功能以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的重要方法，相對(duì)體內(nèi)研究而言影響因素單一[16]。目前，有關(guān)ICC的體外培養(yǎng)，國(guó)外的研究尚少，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。在本課題研究，我們擬在建立ICC體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，構(gòu)建

5、SCL表達(dá)載體，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)上調(diào)體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子SCL蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而探討SCL轉(zhuǎn)基因?qū)w外培養(yǎng)小鼠小腸ICC表達(dá)c-kit的影響。本研究有望為從核轉(zhuǎn)錄水平治療以ICC減少為背景的胃腸動(dòng)力紊亂性疾病奠定理論基礎(chǔ)。 目的： 1.建立體外培養(yǎng)ICC的方法，探討影響ICC分離、培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，觀察其形態(tài)學(xué)特征和功能； 2.構(gòu)建核轉(zhuǎn)錄因子SCL的真核表達(dá)載體，探討SCL轉(zhuǎn)基因后對(duì)ICC表

6、達(dá)c-kit的影響。 方法： 采用酶消化法結(jié)合密度離心法分離、培養(yǎng)小鼠小腸ICC，c-kit免疫熒光染色對(duì)其進(jìn)行鑒定；從防止污染、保護(hù)ICC功能、促進(jìn)ICC生長(zhǎng)和表型維持等方面探討影響體外分離、培養(yǎng)ICC的關(guān)鍵因素；激光共聚焦顯微鏡和常規(guī)顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC的形態(tài)學(xué)特征；應(yīng)用Ca2+熒光指示劑Fluo-4AM細(xì)胞染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC鈣離子的分布及其振蕩功能，并觀察大黃素對(duì)ICC

7、鈣離子振蕩的影響。構(gòu)建SCL表達(dá)載體pIRES2-EGFP-SCL，并進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。Cy3標(biāo)記的SCL抗體進(jìn)行免疫熒光染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-SCL對(duì)體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC表達(dá)SCL蛋白的影響；凝膠遷移阻滯法檢測(cè)SCL轉(zhuǎn)基因?qū)CC內(nèi)SCL結(jié)合活性的影響；Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染SCL基因?qū)w外培養(yǎng)小鼠小腸ICC表達(dá)c-kit的影響。 結(jié)果： 1.應(yīng)用ICC特異的c-kit單

8、克隆抗體進(jìn)行免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示，c-kit在培養(yǎng)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)。體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC存在明顯的形態(tài)學(xué)特征，ICC接種后24h即可貼壁，細(xì)胞最初呈三角形或梭形，并有少量短突起。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞會(huì)形成與軸突狀長(zhǎng)突起。體外培養(yǎng)3d，ICC即可形成較長(zhǎng)的突起，并與周?chē)?xì)胞形成突觸連接。體外培養(yǎng)7d后，ICC可以伸出二級(jí)、三級(jí)突起，相互連接ICC突起可形成復(fù)雜的網(wǎng)狀連接。ICC在體外可穩(wěn)定培養(yǎng)至少30d以上。 2.應(yīng)用Ca2+熒光

9、指示劑Fluo-4AM進(jìn)行細(xì)胞染色后提示，Ca2+是ICC間連接的重要成分；體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC具有鈣離子振蕩功能，頻率約為22次/min。大黃素可以顯著增強(qiáng)ICC鈣離子振蕩的振幅、頻率(約為34次/min)。 3.核轉(zhuǎn)錄因子SCL表達(dá)載體pIRES2-EGFP-SCL，酶切鑒定和基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果與目的基因一致，Genebank比對(duì)結(jié)果提示與小鼠具有高度的同源性。轉(zhuǎn)染試劑Genejammer能將核轉(zhuǎn)錄因子SCL表達(dá)載體高效率的

10、轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC。 4.應(yīng)用SCL抗體免疫熒光染色提示，正常培養(yǎng)ICC內(nèi)SCL輕度表達(dá)。SCL轉(zhuǎn)基因后，ICC內(nèi)SCL蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(p＜0.05)。EMSA結(jié)果提示，體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC內(nèi)SCL處于輕度活化狀態(tài)，轉(zhuǎn)基因后，ICC內(nèi)SCL的DNA結(jié)合活性明顯提高(p＜0.05)。 5.Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，c-kit在體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC呈陽(yáng)性表達(dá)，SCL轉(zhuǎn)基因后ICC表達(dá)c-kit較正常對(duì)

11、照組和空白質(zhì)粒對(duì)照組顯著增強(qiáng)(p＜0.05)。 結(jié)論： 1.我們成功建立了體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC的方法，在細(xì)胞分離、培養(yǎng)過(guò)程有許多環(huán)節(jié)需要探討，主要包括：避免污染，減少在有害環(huán)境的時(shí)間，避免過(guò)度牽拉，及時(shí)換液，外源性SCF是穩(wěn)定細(xì)胞表型和促進(jìn)ICC生長(zhǎng)的關(guān)鍵。 2.體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC存在明顯的形態(tài)學(xué)特征，ICC突起逐漸變多，變長(zhǎng)，并最終可以形成類(lèi)似于體內(nèi)的廣泛的連接以及網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)的ICC具有鈣離子振