小鼠小腸Cajal間質細胞缺失模型的建立及SCF促其恢復研究.pdf

1、胃腸道Cajal間質細胞(ICC)是一種特殊的間質細胞，近來已證實ICC為胃腸道慢波的起搏器，并參與慢波的傳導，在神經肌肉信號傳遞中也起重要調節(jié)作用。慢波又稱為基本電節(jié)律，決定著胃腸道平滑肌收縮節(jié)律，慢波活動的異常必然會引起胃腸運動功能的紊亂。因此，ICC的異常將會導致胃腸運動紊亂。業(yè)已證明嬰幼兒肥厚性幽門狹窄、Hirschsprung's病、慢傳輸性便秘、慢性假性腸梗阻等眾多胃腸動力紊亂性疾病都存在ICC缺失或缺陷。 隨著IC

2、C表達c-kit的發(fā)現(xiàn)，為ICC的研究帶來了巨大的進展。隨后，人們意識到c-kit與其配體干細胞因子(stemcellfactor，SCF)結合所啟動的信號途徑對ICC的發(fā)生、發(fā)育及表型維持至關重要，SCF/c-kit信號途徑異常是引起ICC缺失及慢波消失的主要原因。ICC具有可塑性的特點，ICC缺失后有恢復正常的可能。那么從恢復SCF/c-kit信號途徑入手則有望促使ICC恢復。但目前尚未見相關研究報道。 為此，本實驗將從IC

3、C入手，建立一種ICC缺失模型，并觀察SCF促使其恢復的作用，可望拓展ICC和胃腸動力研究領域，并將為胃腸運動紊亂的治療提供新思路。 目的：1.觀察Balb/c小鼠小腸中ICC的形態(tài)特征以及小腸在體慢波活動情況； 2.通過阻斷c-kit受體的作用來建立小鼠小腸ICC缺失模型并初步探討其發(fā)生機制； 3.從小腸肌條離體培養(yǎng)層面觀察SCF促進缺失的ICC恢復作用； 4.從在體動物層面觀察SCF促進缺失的ICC恢

4、復作用。 方法：1.選取成年Balb/c小鼠，記錄小腸在體慢波活動情況，并采用免疫組化法觀察ICC的分布及形態(tài)特征； 2.選取新出生Balb/c小鼠，腹腔內隔天注射c-kit抗體(ACK2)100μg，共5次，對照組注射生理鹽水，于10d后測定小腸慢波，并通過免疫組化法及透射電鏡觀察小腸Caial間質細胞的分布與形態(tài)特征，采用RT-PCR、WesternBlot法檢測c-kit基因轉錄和表達情況，采用TUNEL染色方法檢

5、測原位細胞凋亡； 3.取ICC缺失模型小鼠小腸肌條離體培養(yǎng)，觀察SCF0ng/ml、50ng/ml及100ng/ml三種不同濃度培養(yǎng)1d、3d及5d對小腸肌條慢波活動的影響；選取最佳SCF濃度及培養(yǎng)時相點，采用免疫組化法觀察ICC的分布及形態(tài)特征，采用RT-PCR、WesternBlot法檢測c-kit基因轉錄和表達情況； 4.取ICC缺失模型小鼠，根據(jù)SCF臨床應用劑量，腹腔注射SCF30μg/kg·d，連續(xù)注射5d后

6、觀察小腸在體慢波活動及Cajal間質細胞分布、c-kit表達情況。 結果：1.成年Balb/c小鼠小腸在體慢波表現(xiàn)為不規(guī)則的近似正弦波樣曲線；慢波頻率為17.78士1.52次/min，頻率變異系數(shù)為8.55％，慢波振幅為0.16mV±0.02mV，振幅變異系數(shù)為14.11％； 2.免疫組化顯示ICC主要分布在小腸肌間神經叢區(qū)(稱為ICC-MY)以及環(huán)肌層的深肌層叢區(qū)(稱為ICC-DMP)，ICC-MY在切面上呈連續(xù)性分布

7、條帶； 3.10d大小的對照組小鼠小腸在體慢波及ICC的分布情況均類似于成年小鼠。而ACK2處理的實驗組小鼠小腸在體慢波活動無節(jié)律，頻率與振幅均較低，頻率為2.38士0.89次/min，振幅為0.045mV±0.012mV，與對照組存在著顯著差異(p＜0.01)；并且ICC缺失，未能檢測到c-kitmRNA以及c-kit蛋白的表達； 4.原位細胞凋亡檢測顯示，ACK2處理的實驗組小腸粘膜層和粘膜下層均見明顯的細胞凋亡現(xiàn)象

8、，但肌間神經叢區(qū)卻未見明顯細胞凋亡； 5.超微結構觀察顯示ACK2處理的實驗組未見典型的ICC，也未見明顯的壞死細胞和凋亡小體，偶可見到一種類似于ICC的細胞，但其內線粒體數(shù)量明顯減少； 6.將ICC缺失小鼠小腸肌條行離體培養(yǎng)，結果顯示SCF50ng/ml作用5d可使小腸肌條慢波頻率明顯加快；SCF100ng/ml作用3d就可使小腸肌條慢波頻率明顯加快，但作用5d時則更顯著，且振幅也加大(p＜0.05，與SCF0ng/m

9、l比較)； 7.SCF100ng/ml作用于ICC缺失小鼠離體培養(yǎng)的小腸肌條5d后，可在肌間神經叢區(qū)觀察到ICC，但其分布不完整；SCF作用后c-kitmRNA及c-kit蛋白表達也增強(p＜0.05，與SCF0ng/ml比較)，卻仍明顯低于正常對照組； 8.SCF腹腔注射給藥可使ICC缺失小鼠小腸在體慢波頻率明顯增快(p＜0.01，與NS給藥組比較)，振幅也有加大(p＜0.05，與NS給藥組比較)；SCF作用后可在肌間

10、神經叢區(qū)觀察到ICC，但其分布不完整，并且c-kitmRNA及c-kit蛋白表達也增強(p＜0.05，與NS給藥組比較)，卻仍明顯低于正常對照組。 結論：1.Balb/c小鼠小腸ICC主要分布著ICC-MY及ICC-DMP兩類，為雙極或多極細胞，ICC-MY相互連接成網(wǎng)絡狀，與平滑肌細胞及神經元關系密切； 2.阻斷c-kit可導致ICC缺失及慢波消失，并且ICC的缺失很可能是因為發(fā)生了表型轉變而不是凋亡或壞死；