在小鼠背根神經(jīng)節(jié)中與TRPV1通道互作蛋白的篩選及PI3K-p85β對(duì)TRPV1通道功能調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、瞬時(shí)感受器電位離子通道香草素受體亞型1（Transient receptor potential Vanilloid1，TRPV1)，是一個(gè)含有6次跨膜結(jié)構(gòu)的非選擇性通透陽離子的離子通道，它能夠被辣椒素、炎性介質(zhì)、酸、以及內(nèi)源性的大麻素和花生四烯酸等所激活，同時(shí)還能夠響應(yīng)溫度刺激（＞42℃）。由于能夠響應(yīng)種類眾多的刺激，TRPV1通道因此被稱為多覺感受器（Polymodal Receptor）。TRPV1通道廣泛存在于酵母到人類等多種物

2、種，主要分布在腦組織和初級(jí)感覺傳入神經(jīng)末梢，在一些非神經(jīng)組織如皮膚角質(zhì)細(xì)胞、膀胱粘膜上皮細(xì)胞、胃腸道、干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、肺泡壁細(xì)胞、肥大細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中也有表達(dá)，在痛覺傳遞和調(diào)制，整合多種疼痛信息等方面發(fā)揮重要作用。TRPV1基因敲除小鼠對(duì)熱的反應(yīng)明顯降低甚至缺失，TRPV1阻斷劑可以使動(dòng)物和人的體溫出現(xiàn)升高反應(yīng)，說明TRPV1是熱、痛覺感受和參與體溫調(diào)節(jié)所必須的生物分子?，F(xiàn)已明確TRPV1通道在痛覺傳遞和調(diào)制，整合多種

3、疼痛信息等方面發(fā)揮重要作用。時(shí)至今日，已發(fā)現(xiàn)的能激活TRPV1通道蛋白的刺激物大部分是外源性的化學(xué)或物理刺激，而內(nèi)源性的對(duì)TRPV1通道具有調(diào)節(jié)作用的蛋白分子尚無太多報(bào)道。由于TRPV1通道蛋白主導(dǎo)傷害性刺激傳導(dǎo)，對(duì)外界傷害性刺激的感知有助于機(jī)體的自我保護(hù)，而該通道蛋白分布非常廣泛，是否存在內(nèi)源性的調(diào)節(jié)蛋白或配體亞基來體現(xiàn)其組織分布與功能的差異性，從而滿足機(jī)體的多層次防護(hù)需要。我們擬對(duì)此進(jìn)行探討。
　　為了發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的對(duì) TRPV

4、1通道蛋白有相互作用的配體分子，我們利用SMARTTM技術(shù)成功構(gòu)建了小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Dorsal Root Ganglion，DRG）的cDNA文庫(kù)，并經(jīng)文庫(kù)滴度及插入片段的比對(duì)檢測(cè)，證實(shí)其質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)篩選的要求。以rTRPV1通道蛋白的胞內(nèi)N末端（1-432aa）作為誘餌融合蛋白，和含有DRG文庫(kù)的菌株進(jìn)行融合培養(yǎng)。經(jīng)過報(bào)告基因His、Ade、LacZ進(jìn)行三輪篩選，共獲得了120個(gè)陽性克隆，繼而對(duì)所獲得的陽性克隆分別進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)粒提

5、取和測(cè)序分析，初步得到13種不同的文庫(kù)蛋白。接著分別將所獲文庫(kù)質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒同時(shí)回轉(zhuǎn)至酵母感受態(tài)菌株中，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上培養(yǎng)進(jìn)行回復(fù)性驗(yàn)證，證實(shí)上述篩選實(shí)驗(yàn)得到了8種不同的文庫(kù)蛋白。我們初步從中選取了一個(gè)文庫(kù)質(zhì)粒，通過測(cè)序分析及NCBI網(wǎng)站上的序列比對(duì)，證實(shí)其為PI3K-p85β蛋白，即磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K）的調(diào)節(jié)亞基 p85β。接下來，我們分別構(gòu)建了TRPV1-Nt-FLAG，T

6、RPV1-FLAG和PI3K-p85β-GFP三種不同的表達(dá)載體，通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)二者在細(xì)胞內(nèi)的確存在相互作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證二者間的相互作用，我們分別構(gòu)建了綠色和紅色熒光蛋白融合表達(dá)質(zhì)粒，PI3K-p85β-GFP和TRPV1-RFP，共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，利用激光共聚焦顯微技術(shù)觀察，結(jié)果顯示在細(xì)胞膜上能夠分別觀察到綠色和紅色熒光信號(hào)，圖片重疊后可見清晰的黃色，說明兩者在細(xì)胞膜上具有共定位特性。
　　美國(guó)華盛頓大學(xué)的Dr

7、.Gordon研究小組在人的胎腦文庫(kù)中利用酵母雙雜交方法，發(fā)現(xiàn)PI3K-p85β和TRPV1通道具有相互作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nerve Growth Factor，NGF）和其受體trkA結(jié)合后，可以激活PI3K，活化后的PI3K通過磷酸化磷酸肌醇4,5二磷酸PI(4,5)P2而生成PI(3,4,5)P3，而PIP3可以增強(qiáng)TRPV1通道蛋白向細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)與表達(dá)，而提高TRPV1通道在細(xì)胞膜上的表達(dá)數(shù)量。為了觀察我們?cè)谛?/p>

8、鼠DRG中篩選得到的PI3K-p85β是否對(duì)TRPV1通道具有類似的調(diào)節(jié)作用，我們將TrkA、PI3K-p85β和TRPV1同時(shí)表達(dá)在HEK293T細(xì)胞中，通過全細(xì)胞膜片鉗記錄實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過100 ng/ml的NGF連續(xù)處理6 min后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，TRPV1通道對(duì)低濃度（0.1μM）和高濃度（1μM）的辣椒素響應(yīng)均顯著增強(qiáng)。我們的研究結(jié)果表明PI3K信號(hào)通路對(duì)TRPV1通道蛋白的功能的確具有調(diào)節(jié)作用。
　　以上研究