持續(xù)機(jī)械刺激對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV4通道的影響和差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景: 當(dāng)活細(xì)胞和有機(jī)體受到環(huán)境中的機(jī)械刺激時(shí)，機(jī)械信號(hào)隨即轉(zhuǎn)化成生物信號(hào)，使細(xì)胞作出適當(dāng)反應(yīng)，此過(guò)程被稱為機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)。在機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，機(jī)械敏感性離子通道(mechanosensitive channel，MS通道)起了很重要作用。MS通道是一類通道開放概率隨細(xì)胞膜張力變化呈現(xiàn)相應(yīng)變化的離子通道，能夠?qū)⑹┘釉诜肿幽ど系臋C(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)或生化信號(hào)。自從在雞胚骨骼肌細(xì)胞和蛙肌肉上發(fā)現(xiàn)MS通道以來(lái)，在許多類型的細(xì)胞上都發(fā)現(xiàn)了M

2、S通道。1999年，McCarter首次在大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)上發(fā)現(xiàn)了機(jī)械敏感性全細(xì)胞電流，隨后有研究小組使用不同的刺激方法在DRG上記錄到了幾種MS通道，由于細(xì)胞類型，刺激方法，記錄方法和電極液、浴液成分的不同，這些通道的電生理性質(zhì)不完全相同，也無(wú)法確定是否是同樣的通道。 DRG是軀體感覺初級(jí)傳入神經(jīng)元細(xì)胞體的聚集處，由于其特殊的解剖位置和生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，易于受到機(jī)械壓迫刺激，從而產(chǎn)

3、生根性疼痛。但這種病理性疼痛的電生理機(jī)制尚不明確。研究大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜上的MS通道的生物物理學(xué)特性及通道的分布，可為進(jìn)一步了解：DRG神經(jīng)元細(xì)胞電活動(dòng)的機(jī)制提供依據(jù)。 目的: 研究大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜上的MS通道的生物物理學(xué)特性及通道的分布。 方法: 將新生大鼠DRG細(xì)胞培養(yǎng)4天后，應(yīng)用細(xì)胞貼附式和內(nèi)面向外式膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞膜上的MS通道電流，分析通道的電生理性質(zhì)，如壓力-電流關(guān)系、電壓-電流關(guān)

4、系，開放動(dòng)力學(xué)，離子選擇性，影響因素和通道在DRG細(xì)胞上的分布。本試驗(yàn)采用的機(jī)械刺激方式為負(fù)壓抽吸。 結(jié)果: 1.壓力-電流關(guān)系操縱微電極接近DRG神經(jīng)元，形成細(xì)胞貼附式膜片鉗記錄方式，保持膜電壓(membrane voltage，Vm)為-60mV，在未施加負(fù)壓時(shí)，通道的自發(fā)性開放很少。逐漸增大所施負(fù)壓的值，當(dāng)負(fù)壓為-12～-15mmHg時(shí)，開始出現(xiàn)內(nèi)向電流。細(xì)胞膜能承受的最大負(fù)壓約為-50mmHg，更大的負(fù)壓可以破壞

5、細(xì)胞膜。P1/2=36.66±0.455mmHg(n=25)。 Vm=-60mV 時(shí)的平均幅度為-3.40±0.04pA(n=125)。同一電壓下，隨壓力的增大，通道開放概率(NPo)逐漸增大(P＜0.01，n=25)，但不同壓力產(chǎn)生的電流的幅度無(wú)差別(P＞0.05，n=25)。同一電壓下，細(xì)胞貼附式記錄方式，Vm=-60mV，在-50mmHg負(fù)壓下，平均NPo為0.448±0.03(n=25)。 2.電壓-電流關(guān)系形成內(nèi)面向外

6、式膜片鉗記錄方式，在持續(xù)施加負(fù)壓-40mmHg，在膜電壓為正值時(shí)，表現(xiàn)為外向電流，+60mV時(shí)電流的弦電導(dǎo)為96.15±3.734 pS(+40～+60mV)。當(dāng)膜電壓為負(fù)值時(shí)，表現(xiàn)為內(nèi)向電流，同時(shí)表現(xiàn)出內(nèi)向整流特性，內(nèi)向電流(-60～0mV)的斜率電導(dǎo)為62.47±2.72 pS。平衡溶液中，平均逆轉(zhuǎn)電位Erev=-2.33±0.255mV。 3.通道動(dòng)力學(xué)形成內(nèi)面向外式膜片鉗記錄方式，Vm=-60mV，當(dāng)負(fù)壓為-20mmHg

7、時(shí)，雙指數(shù)擬合所得兩個(gè)開放常數(shù)分別為1.338+0.098ms和13.001±0.649ms，關(guān)閉常數(shù)分別為2.462±0.267ms和23.386±1.206ms。當(dāng)負(fù)壓為-40mmHg時(shí)，短開放時(shí)間常數(shù)和長(zhǎng)開放時(shí)間常數(shù)分別變?yōu)?.744±0.195ms和17.92±1.623ms，明顯高于-20mmHg壓力下的時(shí)間常數(shù)(both P＜0.05)。此時(shí)的短關(guān)閉時(shí)間常數(shù)和長(zhǎng)關(guān)閉時(shí)間常數(shù)分別變?yōu)?.266±0.154 ms和14.071±

8、0.797ms。與負(fù)壓為-20mmHg時(shí)相比，長(zhǎng)關(guān)閉時(shí)間常數(shù)明顯減少(P＜0.05)，短關(guān)閉時(shí)間變化不大(P=0.545)，可見壓力是通過(guò)增加開放時(shí)間和減少長(zhǎng)關(guān)閉時(shí)間來(lái)增加通道的活性的。 4.離子選擇性本研究記錄到的通道為非選擇性陽(yáng)離子通道，對(duì)陰離子沒有通透性。 5.影響因素 該通道對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)可被釓和秋水仙素阻斷，河豚毒素可阻斷大直徑神經(jīng)元上的電流，對(duì)小直徑細(xì)胞無(wú)效。阿米洛利對(duì)該電流無(wú)效。 6.MS通道的分