凝血酶對(duì)體外培養(yǎng)的家兔虹膜色素上皮細(xì)胞的增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討凝血酶對(duì)虹膜色素上皮細(xì)胞的影響。本實(shí)驗(yàn)將研究凝血酶對(duì)虹膜色素上皮細(xì)胞的生長的增殖作用，為進(jìn)一步由虹膜色素上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化生成晶狀體提供一些實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。 方法： 1、體外培養(yǎng)家兔虹膜色素上皮細(xì)胞。 2、對(duì)培養(yǎng)的家兔虹膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)鑒定。 3、利用體外培養(yǎng)的虹膜色素上皮細(xì)胞，觀察不同濃度的凝血酶對(duì)虹膜色素上皮細(xì)胞的影響。將虹膜色素上皮細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml，隨機(jī)分為5組

2、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(1-5組)，1組為對(duì)照組，2-5組為實(shí)驗(yàn)組，分別加入0.1，0.5，1.0，5.0NU/ml的凝血酶，37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。用MTT法測(cè)定各孔貼壁細(xì)胞數(shù)量的吸光度值。 4、根據(jù)上一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選定0.5NU/ml為實(shí)驗(yàn)組加入凝血酶的濃度。將培養(yǎng)的細(xì)胞調(diào)整濃度，接種至96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml，隨機(jī)分為兩組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組加入0.5NU/ml的凝血酶，實(shí)驗(yàn)組加入0.5NU/ml的凝血酶和等量的凝

3、血酶抑制劑，37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。用MTT法測(cè)定各孔貼壁細(xì)胞數(shù)量的吸光度值。 5、數(shù)據(jù)分析用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果采用t檢驗(yàn)，以P<0.05作為差異有顯著意義。 結(jié)果： 1、原代IPE細(xì)胞核圓，胞漿內(nèi)充滿了黑色的色素顆粒。密集處細(xì)胞大多數(shù)為多角形或者為方形，稀疏處細(xì)胞呈梭形。傳代后的細(xì)胞形態(tài)與原代相似，但隨著傳代次數(shù)的增加細(xì)胞體積有所增大，細(xì)胞胞漿中的黑色色素顆粒也越

4、來越少。細(xì)胞逐漸老化，胞漿界限模糊。 2、細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果幾乎所有細(xì)胞的胞漿都呈現(xiàn)棕黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。 3、不同濃度凝血酶對(duì)虹膜色素上皮細(xì)胞的作用 MTT法結(jié)果顯示，凝血酶對(duì)體外培養(yǎng)的虹膜色素上皮細(xì)胞有增殖作用，具有明顯的劑量依賴性，各組與對(duì)照組之間比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著凝血酶劑量的增加，虹膜色素上皮細(xì)胞的增殖作用也增加。 4、凝血酶及其抑制劑對(duì)虹膜色素上皮細(xì)胞的作用 MTT法結(jié)果顯示，凝血酶對(duì)體外

5、培養(yǎng)的虹膜色素上皮細(xì)胞的增殖作用能被凝血酶抑制劑所抑制，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 討論： 凝血酶為絲氨酸蛋白酶超家族成員之一，具有酶活性的凝血酶是血漿中凝血酶原經(jīng)由凝血酶原酶復(fù)合物(prothrombinase complex)(凝血因子X a與凝血因子Va結(jié)合形成1：1的復(fù)合物)催化裂解形成。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)凝血酶除了參與血液凝固以及血栓形成的作用外還存在著其他的功能，例如：炎癥反應(yīng)，傷口愈合，組織重建，激活生長因子，

6、胚胎發(fā)生，以及正常和異常的生長調(diào)控。大部分凝血酶在血液中的存在方式是前體形式，即凝血酶原。在傷口處引起血液成分的聚集影響愈合反應(yīng)。 體外培養(yǎng)虹膜色素上皮細(xì)胞在凝血酶的作用下有明顯的增殖，而且細(xì)胞的增殖對(duì)凝血酶具有一定的劑量依賴性。隨著凝血酶的濃度的提高，虹膜色素上皮細(xì)胞的增殖作用也增強(qiáng)。在白內(nèi)障手術(shù)中，手術(shù)刺激使血管的通透性增強(qiáng)以及在手術(shù)過程中血一房水屏障的破壞或者削弱都可能使原本在血管內(nèi)的凝血酶進(jìn)入眼房水中，參與促進(jìn)虹膜色素上

7、皮細(xì)胞增殖生長的活動(dòng)。當(dāng)加入凝血酶抑制劑后，虹膜色素上皮細(xì)胞的生長即被抑制。很明顯，凝血酶對(duì)于虹膜色素上皮細(xì)胞的促進(jìn)其增殖的作用可以通過凝血酶的抑制劑而抑制。但是，我們可以看出雖然凝血酶抑制劑的抑制作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是不能完全抑制，也就是說，凝血酶在對(duì)虹膜色素上皮細(xì)胞的促進(jìn)增殖的作用中，不單單是本身的直接作用，可能還存在其衍生物或者其他作用，這些額外的作用目前還不了解，尚有待研究。凝血酶對(duì)體外培養(yǎng)的虹膜色素上皮細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用，