提高乙型肝炎病毒P基因區(qū)PCR檢測(cè)陽(yáng)性率的策略及阿德福韋酯治療中HBV基因型耐藥臨床監(jiān)測(cè)研究.pdf

1、抗病毒治療是改善慢性乙型肝炎患者預(yù)后、提高生活質(zhì)量的主要措施。核苷(酸)類似物的臨床應(yīng)用極大地改善了病人的病情。理論上,所有口服核苷(酸)類似物在治療過程中均可出現(xiàn)耐藥性,HBV對(duì)核苷類抗病毒藥物產(chǎn)生的耐藥性是阻礙其臨床應(yīng)用、降低其療效的主要原因。因此在慢性HBV感染抗病毒治療中進(jìn)行耐藥基因監(jiān)測(cè)對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥,包括撤換或增加其他核苷(酸)類似物十分重要,倍受臨床重視。HBV基因變異已經(jīng)被證明與HBV的耐藥性有直接的因果關(guān)系。HBV變異

2、的出現(xiàn)可通過基因型檢測(cè)來(lái)診斷,而PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法能夠鑒定已知的并發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)。為了鑒定潛在的基因型耐藥,在病毒學(xué)突破時(shí)分離提取的HBV DNA序列及其推導(dǎo)出的氨基酸序列需與患者治療前標(biāo)本的序列和野毒株序列相對(duì)比以確定導(dǎo)致對(duì)某種抗病毒藥物耐藥的位點(diǎn)替換。長(zhǎng)期以來(lái),人們對(duì)PCR假陰性問題認(rèn)識(shí)不足。在實(shí)際應(yīng)用中有許多因素可能造成假陰性結(jié)果,要成功地得到靶序列的擴(kuò)增,PCR要求模板、引物、dNTP、DNA聚合酶和緩沖液之間的無(wú)數(shù)復(fù)雜

3、相互作用。由于HBV DNA的P基因區(qū)是非保守區(qū),檢測(cè)時(shí)可能會(huì)由于引物結(jié)合區(qū)的堿基的變異而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此提高HBVP基因區(qū)PCR的檢測(cè)陽(yáng)性率,是了解病毒變異情況的前提,它對(duì)在慢性HBV感染抗病毒治療中進(jìn)行耐藥基因監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義。本研究采用一些綜合措施提高了HBV DNA P基因區(qū)PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率。在此基礎(chǔ)上,建立了包含有拉米夫定、阿德福韋及恩替卡韋耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)堿基P基因區(qū)的PCR檢測(cè)方法,并以阿德福韋酯治療乙肝病人為

4、研究對(duì)象,擴(kuò)增病人不同治療觀察點(diǎn)血清HBVDNA,進(jìn)行DNA序列分析,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HBV基因型耐藥變化。 第一部分：提高乙型肝炎病毒P基因區(qū)PCR檢測(cè)陽(yáng)性率的策略 目的提高HBV DNA P基因區(qū)PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率,了解病毒基因型耐藥與臨床耐藥之間相互關(guān)系。 方法： (1)通過采用①比較7種HBV DNA抽提技術(shù)的DNA抽提得率,②優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,③選擇最佳引物,④降低退火溫度,⑤3'末端堿基游移兼并引物

5、以減少引物與模板引物結(jié)合區(qū)的錯(cuò)配對(duì)PCR的影響等五種方法,對(duì)常規(guī)PCR檢測(cè)HBV DNA P基因區(qū)陰性的病人血清再進(jìn)行PCR檢測(cè)。 (2)以372例拉米夫定治療失敗乙肝病人為研究對(duì)象,擴(kuò)增病人血清HBV DNA,進(jìn)行DNA序列分析,監(jiān)測(cè)HBV基因型耐藥變化。 結(jié)果： ①在7種抽提方法中血清直接沸水浴、經(jīng)典的蛋白酶裂解+酚/氯仿抽提法、蛋白酶裂解+酚/氯仿抽提法省缺乙醇沉淀以及柱抽提法的HBV DNA抽提得率分別為

6、75.2％、13.8％、21.9％、31.0％；用堿變性裂解和蛋白酶裂解后沸水浴所得上清,以及血清直接作為模板,PCR后不能得到陽(yáng)性擴(kuò)增條帶；沸水浴時(shí)間在5～7分鐘能獲得最多的PCR產(chǎn)物。 ②本研究條件下,優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件確定為：采用直接沸水浴法抽提血清HBV DNA;模板上樣量5μl,10×PCR緩沖液5μl,MgCl2(25mmol/L)3μl,4×dNTP(10mmol/L)1μl,上、下游引物各12.5pmol,Ta

7、q DNA聚合酶1U,用去離子水補(bǔ)充至總體積50μl;PCR反應(yīng)過程：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒,53℃退火30秒,72℃延伸45秒,共38循環(huán)；72℃再延伸5分鐘。 ③通過降低退火溫度及減少3'末端錯(cuò)配,PCR檢測(cè)陽(yáng)性率由81.7％(67/82)增加至92.7％(76/82)(P<0.05)。 ④372例病人拉米夫定平均治療時(shí)間為30.35±6.82月,來(lái)自不同病人的372份血清標(biāo)本中P基因區(qū)PCR陽(yáng)性339

8、份,陽(yáng)性率91.1％；所有陽(yáng)性標(biāo)本均測(cè)序成功。測(cè)序結(jié)果經(jīng)與野生株YMDD基序基因比對(duì)后,共檢出YMDD變異193株(51.2％),其中M240I 104株(28.0％),M204V 68株(18.3％),M204V/I混合變異株18株(4.84％),CVDD(半胱氨酸-纈氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸)1株(0.27％),YMDH(酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-組氨酸)1株(0.27％),YMHD/YIHD(酪氨酸-異亮氨酸-天門冬氨酸-組

9、冬氨酸)混合變異1株(0.27％)。 結(jié)論： ①核酸抽提方法選擇不當(dāng)能直接影響基因檢測(cè)的靈敏度,導(dǎo)致基因定量準(zhǔn)確性下降。血清直接沸水浴法HBV DNA得率高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、經(jīng)濟(jì),值得推薦。 ②綜合采用優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,選擇引物,降低退火溫度以及應(yīng)用3'末端堿基游移兼并引物等方法可提高基因高突變區(qū)PCR檢測(cè)陽(yáng)性率。 ③拉米夫定治療失敗乙肝病人存在較高比例HBV YMDD基序變異,最常見變異為M240I、

10、M204V和M204V/I混合變異株。 第二部分：阿德福韋酯治療中HBV基因型耐藥臨床監(jiān)測(cè)研究 目的：觀察阿德福韋酯治療慢性乙肝病人是否存在相關(guān)基因自然變異和變異病毒株處于優(yōu)勢(shì)地位的發(fā)生時(shí)間,以期了解基因型耐藥與臨床耐藥之間相互關(guān)系,并對(duì)基因型耐藥發(fā)生的相關(guān)危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析。 方法：56例口服賀維力(阿德福韋酯片10mg,每日一次)病人,在治療前(基線)、治療第4周、第12周、第24周、第36周、第48(或52)

11、周分別采集血清標(biāo)本。標(biāo)本進(jìn)行肝功能全套、HBV血清標(biāo)志物檢測(cè),HBV DNA定量檢測(cè)。HBV DNA陽(yáng)性者,采用已建立的包含有拉米夫定、阿德福韋及恩替卡韋等已知耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)堿基HBV P基因區(qū)的PCR檢測(cè)方法,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病毒基因型耐藥變化。 結(jié)果： ①阿德福韋治療48周時(shí),56例病人中出現(xiàn)病毒學(xué)無(wú)應(yīng)答病人2例,病毒學(xué)突破病人12例,共占被研究人數(shù)25％(14/56)。 ②56例病人基線血清均獲得PCR陽(yáng)性結(jié)果,

12、并測(cè)序成功。測(cè)序結(jié)果顯示：除1例發(fā)生rt233ATA-GTA的堿基置換外,所有病例基線優(yōu)勢(shì)病毒株均與野生株一致,48周治療結(jié)束時(shí),該病人獲得完全生化學(xué)和病毒學(xué)應(yīng)答；基線時(shí),4例病人存在相關(guān)位點(diǎn)的氨基酸變異非優(yōu)勢(shì)株,但病人未出現(xiàn)病毒學(xué)無(wú)應(yīng)答或病毒學(xué)突破。 ③出現(xiàn)病毒學(xué)無(wú)應(yīng)答或病毒學(xué)突破的14例病人,不論在基線還是在治療48周后均未檢測(cè)到已知相關(guān)位點(diǎn)堿基變異。 ④Logistic逐步回歸表明,患者性別、年齡、HBeAg狀態(tài)、