六味地黃丸聯(lián)合bFGF誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的:通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，探討分離、培養(yǎng)、純化和鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的方法，觀察滋補(bǔ)肝腎中藥六味地黃丸聯(lián)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblast growth factor，bFGF)體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的作用，探索獲得較高比例神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)方法。
　　方法:采用全骨髓貼壁分離法分離、培養(yǎng)SD大鼠BMSC

2、s，以純化的BMSCs為研究對(duì)象，觀察細(xì)胞形態(tài)變化、生長(zhǎng)增殖狀態(tài)，MTT法檢測(cè)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志物CD44、CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)，鑒定BMSCs。鑒定后，第3代細(xì)胞經(jīng)bFGF預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)后按空白組、bFGF組、六味地黃丸組、bFGF+六味地黃丸組分別加入相應(yīng)誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化;誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志物巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖

3、維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.采用全骨髓貼壁分離法獲得原代BMSCs，隨多次換液棄懸浮細(xì)胞傳代棄其它貼壁細(xì)胞后得到純化的BMSCs。經(jīng)分離培養(yǎng)的第3代細(xì)胞增殖旺盛，具有較好的活力，利于誘導(dǎo)進(jìn)行。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示CD44呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34呈陰性表達(dá)。
　　2.生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs經(jīng)bFGF預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)后與空白組相比，細(xì)胞數(shù)量增多，立體感增強(qiáng);各組BMSCs分別以不同誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，2～3天細(xì)胞

4、胞體收縮，形成圓形、不規(guī)整的錐形或三角形;4～5天，部分細(xì)胞逐漸伸出突起，多為2～3極，呈現(xiàn)較典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài);6～7天，神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)量增多，bFGF+六味地黃丸組更為明顯?？瞻捉M細(xì)胞形態(tài)1～3天未出現(xiàn)明顯改變，但生長(zhǎng)速度明顯減慢，其后出現(xiàn)老化、死亡脫落。
　　3.bFGF組、六味地黃丸組和bFGF+六味地黃丸組均有Nestin、NSE、GFAP陽(yáng)性表達(dá)，bFGF+六味地黃丸組各指標(biāo)陽(yáng)性率高于bFGF組、六味地黃丸組，差異