DNA修復(fù)蛋白Ku及BRCA1在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)沉默的分子機(jī)制.pdf

1、視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的損傷包括諸多因素，但其最終的表現(xiàn)為神經(jīng)元DNA損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。其中，DNA雙鏈斷裂(Double—strand breaks，DSBs)是DNA損傷最嚴(yán)重的一種形式。DNA的修復(fù)能力對于細(xì)胞保持其基因組的完整性具有非常重要的意義，若損傷的DNA無法得到及時、有效修復(fù)，將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。非同源末端連接(DNA non—homologous end—joining，NHEJ)是神經(jīng)元DSBs的主要修復(fù)方式，對神經(jīng)

2、元的存活有很重要的意義。 Ku及BRCA1是DNA非同源末端連接修復(fù)的主要蛋白，在增殖細(xì)胞中起關(guān)鍵的修復(fù)作用；但在終末分化的神經(jīng)元，兩者都沉默。近年來有研究提出，隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)發(fā)育成熟，DNA甲基化程度加強(qiáng)，某些基因啟動子區(qū)的CpG島發(fā)生甲基化，導(dǎo)致該基因沉默。因此，我們推測Ku及BRCA1沉默可能與其啟動子甲基化有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷時DNA斷裂不能及時有效修復(fù)。現(xiàn)將本課題的研究目的、方法、結(jié)果和結(jié)論小結(jié)如下：

3、 研究目的： 1.探討視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Ku和BRCA1基因沉默的分子機(jī)制是否與其啟動子的甲基化有關(guān)； 2.探討視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Ku和BRCA1去甲基化后是否會影響其DNA修復(fù)能力。 研究方法： 1.原代培養(yǎng)SD乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，MAP2免疫熒光法鑒定神經(jīng)細(xì)胞純度。0.5μM，1.0μM，2.0μM5-Aza—CdR(對照組不加5-Aza—CdR)處理，72小時后提取總RNA，RT—PCR檢測5-

4、Aza—CdR對Ku表達(dá)的影響。 2.原代培養(yǎng)SD乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，MAP2免疫熒光法鑒定神經(jīng)細(xì)胞純度。0.5μM，1.0μM，2.0μM5-Aza—CdR(對照組不加5-Aza—CdR)處理，72小時后提取總蛋白檢測Ku的表達(dá)。 3.原代培養(yǎng)純化后的SD乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。0.5μM，1.0μM，2.0μM5-Aza—CdR(對照組不加5-Aza—CdR)處理，72小時后倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照，比較不同組間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

5、突起長度的差異。 4.原代培養(yǎng)純化后的SD乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，5-Aza—CdR處理72小時，然后無血清培養(yǎng)6小時，再恢復(fù)完全培養(yǎng)液，提取DNA，檢測DNA的完整性。 5.Real time PCR進(jìn)一步檢測5-Aza—CdR對原代培養(yǎng)純化后的SD乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞BRCA1表達(dá)的影響。 6.提取原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的DNA通過甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶PCR法檢測BRCA1啟動子的甲基化情況。 結(jié)

6、果： 1.原代培養(yǎng)SD乳鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞，MAP2免疫熒光法鑒定神經(jīng)細(xì)胞純度，所培養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞中，MAP2陽性細(xì)胞87％。 2.RT—PCR檢測表明，5-Aza—CdR處理的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中，Ku的mRNA表達(dá)較對照組有明顯增加。 3.Western Blot檢測顯示，5-Aza—CdR處理的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Ku蛋白的表達(dá)較對照組有明顯增加。 4.普通光鏡下觀察純化后的SD乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，經(jīng)5-Aza—

7、CdR處理組的軸突長度較對照組縮短。 5.DNA電泳結(jié)果顯示，5-Aza—CdR促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞DNA的修復(fù)，染色體DNA更完整，斷裂的DNA較對照組明顯減少。 6.Real time PCR檢測顯示，加入5-Aza—CdR處理的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞節(jié)BRCA1mRNA的表達(dá)較對照組明顯增加。 7.DNA酶切及PCR驗(yàn)證了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞BRCA1的啟動子中兩個HapⅡ的酶切位點(diǎn)發(fā)生了甲基化。 結(jié)論：