硫氧還蛋白對糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病是一種由多種因素所引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂綜合癥，持續(xù)性高血糖是其主要表現(xiàn)之一，并且長期處于高血糖環(huán)境可以引起視網(wǎng)膜、心臟、腎臟、腦等諸多組織器官的損傷。長期高血糖狀態(tài)，可以引起大量糖基化終末產(chǎn)(AGEs)的積累，有研究表明AGEs在糖尿病所引起的各種組織損傷中發(fā)揮著重要生物學(xué)作用。糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy，DR)是糖尿病一種常見并發(fā)癥，早期研究認(rèn)為該疾病是一種微血管并發(fā)癥

2、；而隨著研究的深入越來越多的學(xué)者認(rèn)為DR是一種神經(jīng)損傷早于血管病變的退行性疾病，但相關(guān)作用機(jī)制不明，因此糖尿病所引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)組織損傷越來越受到人們的關(guān)注，尋找相關(guān)作用靶點及探討相關(guān)作用機(jī)制就顯得極其重要。硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)，是體內(nèi)一種重要的小分子蛋白，在抗氧化、抗凋亡、增殖、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄等過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。蘿卜硫素(Sulforphane，SF)是一種十字花科植物中的有效提取物，在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)

3、可有效上調(diào)硫氧還蛋白的表達(dá)從而延遲視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退行性病變。本論文通過建立糖尿病小鼠模型，同時采用高糖培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，通過不同方法上調(diào)或下調(diào)Trx表達(dá)，研究Trx在糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制，旨在為臨床治療糖尿病視網(wǎng)膜病變提供關(guān)鍵靶點和新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　體內(nèi)研究：Balb/c小鼠，雄性，4~6周，隨機(jī)分為正常對照組(non-diabetes)、糖尿病模型組(diabetes)、糖尿病-蘿卜硫素處理組(

4、diabetes+SF)、糖尿病-蘿卜硫素-PX12聯(lián)合處理組(diabetes+SF+PX12)。采用HE染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)及視網(wǎng)膜感光細(xì)胞核層計數(shù)分析，視網(wǎng)膜凝集素標(biāo)記血管形態(tài)；視網(wǎng)膜電圖(ERG)進(jìn)行視網(wǎng)膜功能檢測；免疫熒光對Opsin、Rhodposin、Trx等相關(guān)蛋白進(jìn)行定位、定性分析；Western blot和Real time PCR對相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。
　　體外研究：選用小鼠視網(wǎng)膜衍生感光細(xì)胞6

5、61w、Neuro2a細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞、RF/6A細(xì)胞、hRPC細(xì)胞，將實驗組分為正常葡萄糖對照組(NG)、高糖處理組(HG)、甘露醇對照處理組(Mannitol)、高糖-蘿卜硫素處理組(HG+SF)、高糖-蘿卜硫素-PX12聯(lián)合作用組(HG+SF+PX12)。采用CCK8法篩選作用于不同細(xì)胞的葡萄糖濃度；流式細(xì)胞術(shù)以及TUNEL染色、DNA-Ladder等方法檢測高糖環(huán)境下細(xì)胞凋亡情況；轉(zhuǎn)基因以及RNA干擾等方法上調(diào)或下調(diào)Trx表

6、達(dá)，探討Trx在高糖所引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中的作用；Western blot和Real-time PCR法檢測相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分糖尿病性視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退行性病變及相關(guān)機(jī)制初探
　　體內(nèi)研究結(jié)果顯示：從HE染色視網(wǎng)膜感光細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析結(jié)果看出，糖尿病組小鼠在發(fā)病后，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞數(shù)與非糖尿病組比較已經(jīng)開始丟失，并隨時間延長不斷減少；而此時的凝集素血管鋪片結(jié)果顯示，糖尿病小鼠視網(wǎng)膜血

7、管與正常組相比形態(tài)無差異。ERG結(jié)果顯示：在糖尿病小鼠中視桿細(xì)胞a波振幅大小在發(fā)病后第10天與對照組比較明顯降低，并隨時間延長不斷減小(p<0.05)；b波振幅大小在發(fā)病后第10天與對照組比較明顯降低并隨時間延長不斷減小(p<0.05)。而在糖尿病小鼠中，視錐細(xì)胞a、b波振幅大小與對照組比較未見明顯變化。另外視桿細(xì)胞功能相關(guān)蛋白Rhodopsin表達(dá)與對照組比較發(fā)生明顯改變，對照組Rhodopsin在內(nèi)外節(jié)表達(dá)分布均勻，而在糖尿病小鼠中

8、，整體表達(dá)分布不均，視網(wǎng)膜各層均有表達(dá)。而視錐細(xì)胞相關(guān)功能蛋白Opsin的表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，但是陽性細(xì)胞數(shù)量未見統(tǒng)計學(xué)差異。
　　體外研究結(jié)果顯示：經(jīng)不同濃度高糖處理后，細(xì)胞凋亡百分比明顯升高，并與高糖濃度呈正相關(guān)；線粒體生物合成相關(guān)基因PGC1a、Nrf1、Tfam表達(dá)以及線粒體膜電位隨著高糖濃度的升高逐漸降低。與對照組比較均有顯著差異(p<0.05)。
　　在體內(nèi)及體外水平結(jié)果顯示：隨著糖尿病發(fā)病時間的延長、高糖濃度的升

9、高，與對照組比較Trx表達(dá)逐漸降低(p<0.05)。
　　第二部分硫氧還蛋白對糖尿病性神經(jīng)血管損傷的影響
　　經(jīng)不同濃度葡萄糖處理Neuro2a、HUVEC、RF/6A、hRPC四種細(xì)胞后，隨著葡萄糖濃度的升高，Neuro2a、hRPC兩種細(xì)胞與對照組比較細(xì)胞存活率明顯降低(p<0.05)，而HUVEC、RF/6A兩種細(xì)胞與對照組比較細(xì)胞存活率未見明顯變化。Real time PCR檢測Trx表達(dá)結(jié)果顯示：經(jīng)不同濃度葡萄糖處

10、理后Neuro2a、hRPC兩種細(xì)胞與對照組比較明顯下調(diào)(p<0.05)，而HUVEC、RF/6A兩種細(xì)胞未見明顯變化。高表達(dá)Trx的Neuro2a-Trx細(xì)胞經(jīng)高糖處理后與Neuro2a細(xì)胞比較凋亡百分比明顯降低(p<0.05)；在HUVEC細(xì)胞中，下調(diào)Trx表達(dá)后，經(jīng)高糖處理后凋亡百分與正常HUVEC細(xì)胞比較明顯升高(p<0.05)。
　　第三部分蘿卜硫素對糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用及相關(guān)機(jī)制研究
　　HE染色分析結(jié)

11、果顯示，糖尿病小鼠與正常小鼠比較視網(wǎng)膜感光細(xì)胞明顯丟失(p<0.05)，而給予SF處理后可以有效抑制視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的丟失(p<0.05)，經(jīng)SF和PX12同時處理后，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的丟失更為明顯(p<0.05)。ERG結(jié)果顯示：糖尿病小鼠a波、b波與正常小鼠比較振幅大小明顯降低(p<0.05)；而給予SF處理后可以有效抑制a波、b波振幅大小的降低(p<0.05)，經(jīng)SF和PX12同時處理a波、b波振幅大小降低更為明顯(p<0.05)。<

12、br>　　采用流式細(xì)胞術(shù)對Neuro2a細(xì)胞進(jìn)行凋亡分析結(jié)果顯示：Neuro2a細(xì)胞經(jīng)高糖處理后，與對照組比較凋亡百分比較明顯上升(p<0.05)；而經(jīng)SF處理后，可以有效抑制其凋亡百分比升高；經(jīng)SF和PX12共同處理后與SF單獨處理時相比較，凋亡百分比明顯升高(p<0.05)。
　　采用real time PCR、Western blot技術(shù)，在Neuro2a細(xì)胞中對相關(guān)通路蛋白在mRNA及蛋白水平表達(dá)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)高糖處理后

13、其ASK1、Txnip與對照組比較明顯升高，而Trx表達(dá)明顯降低(p<0.05)；經(jīng)SF處理后ASK1、Txnip表達(dá)與高糖組比較明顯降低，而Trx表達(dá)明顯升高(p<0.05)；經(jīng)SF和PX12聯(lián)合處理后與SF單獨處理組比較ASK1、Txnip表達(dá)明顯升高，Trx表達(dá)明顯降低(p<0.05)。
　　第四部分硫氧還蛋白抑制糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的體外研究
　　糖尿病小鼠與正常對照組比較視網(wǎng)膜AGE表達(dá)明顯升高，通過PX

14、12或RNAi方法下調(diào)Trx表達(dá)后，再以AGE處理的Neuro2a細(xì)胞凋亡百分比明顯升高、細(xì)胞存活率明顯降低、線粒體膜電位明顯降低、DNA斷裂現(xiàn)象更明顯，與AGE單獨處理組比較均有顯著差異(p<0.05)。經(jīng)SF上調(diào)Trx表達(dá)后，再以AGE處理的Neuro2a細(xì)胞凋亡百分比明顯降低、細(xì)胞存活率明顯升高，與AGE單獨處理組比較均有顯著差異(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　第一部分糖尿病性視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退行性病變及相關(guān)機(jī)制初探

15、
　　1.糖尿病性視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞退行性病變早于血管損傷的發(fā)生。
　　2.糖尿病性視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退行性病變最先發(fā)生在視桿細(xì)胞。
　　3.高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制與線粒體的生物合成抑制或功能障礙有關(guān)
　　4.高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退行性病變的發(fā)生與Trx表達(dá)具有相關(guān)性。
　　第二部分硫氧還蛋白對糖尿病性神經(jīng)血管損傷的影響
　　1.高糖環(huán)境下神經(jīng)細(xì)胞的損傷早于血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，主要原因與二者T

16、rx表達(dá)水平的差異相關(guān)。
　　2.在神經(jīng)細(xì)胞過表達(dá)Trx可以抑制高糖所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　3.在血管內(nèi)皮細(xì)胞下調(diào)Trx表達(dá)可以促進(jìn)高糖所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　第三部分蘿卜硫素對糖尿病性視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用及相關(guān)機(jī)制研究
　　1.蘿卜硫素上調(diào)Trx表達(dá)的主要作用機(jī)制與ERK信號通路相關(guān)。
　　2. Trx在抑制高糖所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的過程中發(fā)揮重要作用，其作用機(jī)制與Trx/ASK1/Txnip信號通路相關(guān)