成年哺乳動物視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞再生的相關(guān)研究.pdf

1、青光眼、視神經(jīng)外傷、視網(wǎng)膜色素變性等疾病是眼科臨床中高發(fā)的不可逆致盲性眼病,極大地危害了患者的身心健康。由于在成年哺乳動物中,損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞無法再生,故治療效果差,治療手段有限,是臨床上的一大難題。本研究從兩方面著手:一是神經(jīng)軸突受損而神經(jīng)元胞體還存活的病理狀況,我們致力于通過研發(fā)組織工程神經(jīng)導(dǎo)管促進(jìn)成年哺乳動物體內(nèi)的視神經(jīng)軸突再生來修復(fù):另一方面是神經(jīng)細(xì)胞也損傷失活、殘存的神經(jīng)細(xì)胞不足以維持正常神經(jīng)功能的病理狀況,我們將成年哺乳

2、動物體內(nèi)的內(nèi)源性因子ephrinA3作為靶點,研究其對視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)作用,從而為治療各種累及視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的疾病打下基礎(chǔ)。
　　第一部分:一種新的組織工程化導(dǎo)管移植促進(jìn)成年大鼠視神經(jīng)再生的實驗研究
　　目的:通過研發(fā)一種新的可降解的組織工程化導(dǎo)管,移植在損傷的視神經(jīng)斷端促進(jìn)成年大鼠的視神經(jīng)軸突生長,從而探索外源性微環(huán)境改變對促進(jìn)視神經(jīng)再生的作用。
　　方法:
　　(1)制備轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞:構(gòu)建GFP

3、-CNTF真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒,用電穿孔法將其轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后3小時-7天在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá)時間和轉(zhuǎn)染效率。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染CNTF后24小時,用RT-PCR檢測CNTF的mRNA表達(dá)情況,并且用免疫組化檢測CNTF蛋白的表達(dá)情況,從而證實基因的轉(zhuǎn)染效果。
　　(2)制備組織工程化導(dǎo)管:用PGA細(xì)絲填充于中空的PLGA導(dǎo)管中,然后分別將轉(zhuǎn)染CNTF的雪旺細(xì)胞或單純雪旺細(xì)胞填充入導(dǎo)管,并過夜培養(yǎng),使細(xì)胞更好地貼附。<

4、br>　　(3)動物實驗:用成年SD大鼠,分成3組,每組6-8只,分別為:
　　①轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組。
　?、谘┩?xì)胞導(dǎo)管組。
　?、劭諏?dǎo)管組。
　　首先手術(shù)造成大鼠視神經(jīng)橫斷傷,然后將各種導(dǎo)管縫合至大鼠視神經(jīng)近側(cè)斷端。
　　(4)評價再生效果:導(dǎo)管移植4周后,用再生軸突標(biāo)記物GAP-43抗體標(biāo)染各組導(dǎo)管的冰凍切片,每張切片從視神經(jīng)斷端開始,每625微米作為一個計數(shù)點,每只大鼠取5張切片進(jìn)行計數(shù)并取得每個

5、距離計數(shù)點再生軸突的平均數(shù),然后對每個距離計數(shù)點的再生軸突數(shù)量在三命實驗組之間用One Way Anova進(jìn)行統(tǒng)計分析。同時,用透射電鏡觀察導(dǎo)管內(nèi)部雪旺細(xì)胞的存活和再生軸突的微細(xì)結(jié)構(gòu)。
　　(5)觀察導(dǎo)管炎癥及降解情況:用巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物OX42抗體標(biāo)染導(dǎo)管冰凍切片以觀察導(dǎo)管內(nèi)炎癥反應(yīng)的情況,并在移植后4周和2個月觀察導(dǎo)管材料的降解情況。
　　結(jié)果:
　　(1)成功制備轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞:測序證明GFP-CNTF

6、質(zhì)粒構(gòu)建成功,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞后3小時綠色熒光開始表達(dá),24小時達(dá)到高峰,可持續(xù)一周。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞24小時后,RT-PCR結(jié)果可見轉(zhuǎn)染CNTF的雪旺細(xì)胞有較高的CNTF mRNA表達(dá),免疫組化結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CNTF的雪旺細(xì)胞表達(dá)CNTF,從而證實了該基因轉(zhuǎn)染方式的有效性。
　　(2)GAP43免疫組化計數(shù)再生神經(jīng)纖維:將三種導(dǎo)管移植在成年大鼠視神經(jīng)橫斷傷末端4周后,用GAP43標(biāo)染組織工程化導(dǎo)管內(nèi)的再生神經(jīng)纖維。在距離視乳頭

7、1875μm的導(dǎo)管內(nèi)部,單純雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組再生軸突的數(shù)量(14.3±2.94/mm/section)和轉(zhuǎn)染CNTF的雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組再生軸突的數(shù)量(16.2±1.56/mm/section)明顯高于對照空導(dǎo)管組(5±2.06/mm/section,P＜0.05,one way anova,n=6或8).說明該組織工程化導(dǎo)管填充雪旺細(xì)胞后具有明顯的促進(jìn)視神經(jīng)再生的作用。在離視神經(jīng)斷端約5000μm的導(dǎo)管內(nèi)部,轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組的再生軸突數(shù)

8、量為4.23±1.18/mm/section,而單純雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組的再生軸突數(shù)量為1.33±0.58/mm/seetion,兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,t檢驗,n=6或8)。在離視神經(jīng)約5625μm的導(dǎo)管內(nèi)部,轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組的再生軸突數(shù)量為2.86±1.08/mm/secfion,而單純雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組的再生軸突數(shù)量為0.3±0.1/mm/section,兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,t檢驗,n=6或8)。說明

9、移植轉(zhuǎn)染CNTF的雪旺細(xì)胞填充的神經(jīng)導(dǎo)管組的再生效果比移植單純雪旺細(xì)胞填充的神經(jīng)導(dǎo)管組好。
　　(3)電鏡觀察再生軸突:導(dǎo)管移植4周后,電鏡觀察見導(dǎo)管內(nèi)轉(zhuǎn)基因的雪旺細(xì)胞導(dǎo)管內(nèi)仍可見存活的雪旺細(xì)胞,并且可見再生神經(jīng)纖維,從而進(jìn)一步證實了軸突的再生。
　　(4)導(dǎo)管內(nèi)部炎癥情況和導(dǎo)管降解情況的觀察:巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物OX42對導(dǎo)管冰凍切片的免疫組化染色顯示移植4周后,導(dǎo)管內(nèi)沒有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。導(dǎo)管在體內(nèi)移植后2個月后降解

10、。
　　結(jié)論:我們成功研制了一種新的可降解的組織工程化神經(jīng)導(dǎo)管,可以有效地促進(jìn)成年大鼠的視神經(jīng)再生.該導(dǎo)管的研發(fā)為將來治療各種神經(jīng)軸突損傷性疾病打下一定研究基礎(chǔ)。
　　第二部分:EphrihA3對成年小鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖及分化作用的研究
　　目的:探索ephrinA3在成年小鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞龕內(nèi)的作用,并探討其作用機(jī)制,為尋找新的調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖和分化的靶點,從而為調(diào)控視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖和分化,治療各種視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞變

11、性疾病打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)檢測ephrinA3在小鼠視網(wǎng)膜上的表達(dá)情況:用Western blot檢測不同年齡的小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)ephrinA3的表達(dá)趨勢,并用免疫組化的方法觀察在成年小鼠的視網(wǎng)膜ephrinA3的表達(dá)部位。
　　(2)在體實驗觀察ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞的增殖情況:用Brdu活體標(biāo)記,免疫組化染色,并在熒光顯微鏡下計數(shù)觀察成年ephrinA3基因敲除鼠和成年野生鼠體內(nèi)的

12、視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖情況。
　　(3)體外實驗觀察ephrinA3對視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖的影響:離體培養(yǎng)ephrinA3基因敲除小鼠和野生鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞,比較其形成原代和第二代神經(jīng)球的數(shù)量,另外用BrdU摻入實驗比較兩種視網(wǎng)膜干細(xì)胞的增殖能力。培養(yǎng)野生型視網(wǎng)膜干細(xì)胞,加入ephrinA3蛋白,比較加入ephrinA3蛋白組和對照組干細(xì)胞的增殖能力。
　　(4)比較兩種神經(jīng)球干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況:用Real-time PCR及RT-

13、PCR的方法比較兩種神經(jīng)球的各種干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況。
　　(5)比較兩種視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分化情況:體外誘導(dǎo)分化視網(wǎng)膜干細(xì)胞,并用各種細(xì)胞標(biāo)記物標(biāo)染以觀察其分化情況。用Real-time PCR的方法比較干細(xì)胞分化前后干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況,以及比較ephrinA3基因敲除干細(xì)胞和野生型干細(xì)胞分化后各種視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況。
　　(6)ephfinA3受體分子的研究:用。RT-PCR檢測在野生型神經(jīng)球中EphA4和Ep

14、hA7的表達(dá)情況,并用免疫沉淀檢測野生鼠睫狀體上皮組織中ephrinA3的相應(yīng)受體,用免疫組化檢測EphA4在成年小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)部位,并用western blot檢測ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠睫狀體上皮組織中EphA4磷酸化程度的不同,從而推測EphA4和ephrinA3之間的關(guān)系。
　　(7)探索ephrinA3作用的下游分子通路:用Wnt3a加入培養(yǎng)的野生型視網(wǎng)膜干細(xì)胞中,通過檢測BrdU摻入實驗來觀察Wnt3a對

15、視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖能力的影響。用Western blot檢測ephrinA3基因敲除視網(wǎng)膜干細(xì)胞和野生型視網(wǎng)膜干細(xì)胞中Wnt3a的下游通路分子β-catenin的表達(dá)及該分子的磷酸化程度,從而推測ephrinA3的下游分子通路。
　　結(jié)果:
　　(1)ephrinA3在小鼠視網(wǎng)膜上的表達(dá)情況:Western blot結(jié)果顯示,ephrinA3從出生后10天開始可以在視網(wǎng)膜組織中檢測得到,在成年期表達(dá)有所增強(qiáng)。在成年小鼠的視網(wǎng)膜

16、,ephrinA3主要表達(dá)在視網(wǎng)膜的內(nèi)叢狀層和外叢狀層,并較低地表達(dá)在睫狀體上皮組織。
　　(2)在體實驗觀察ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞的增殖情況:通過BrdU活體標(biāo)記后染色計數(shù)可知,成年ephrihA3基因敲除鼠睫狀體邊緣部的增殖細(xì)胞數(shù)量為0.0835±0.0478個/切片,明顯多于成年野生型小鼠睫狀體邊緣部的增殖細(xì)胞數(shù)量0.00337±0.00337個/切片(P＜0.05,Mann-Whitney Rank

17、 Sum Test,n=9)。而且增殖細(xì)胞可同時標(biāo)染干細(xì)胞標(biāo)記物Chx10,說明這些增殖細(xì)胞為視網(wǎng)膜的干細(xì)胞。
　　(3)體外實驗觀察ephrinA3對視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖的影響:在離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),ephrinA3基因敲除鼠組所生成的原代神經(jīng)球的數(shù)量是野生型小鼠組的1.72±0.07倍(P＜0.01,t檢驗,n=3);ephrihA3基因敲除小鼠組生成第二代神經(jīng)球的數(shù)量是野生型小鼠組的2.13±0.235倍(P＜0.01,t檢驗,n=

18、3);ephrihA3基因敲除小鼠組的視網(wǎng)膜干細(xì)胞BrdU摻入百分比(57.5％±2.4％)高于野生小鼠組(34％±5.2％)(P＜0.05,t檢驗,n=3),說明ephrinA3基因敲除組視網(wǎng)膜干細(xì)胞的增殖能力高于野生小鼠的視網(wǎng)膜干細(xì)胞。如果在培養(yǎng)皿中加入ephrinA3蛋白,野生型的視網(wǎng)膜干細(xì)胞BrdU摻入百分比會從原來的33.8％±0.8％下降至25.6％±0.8％(P＜0.05,t檢驗,n=3),進(jìn)一步說明了ephrihA3蛋白

19、對視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖的抑制性作用。
　　(4)比較兩種神經(jīng)球干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況:Rod-time PCR結(jié)果證實,ephrinA3基因敲除的視網(wǎng)膜干細(xì)胞的各種干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)量高于野生型視網(wǎng)膜干細(xì)胞,尤其是Writ家族表達(dá)上調(diào)最為明顯。
　　(5)比較兩種視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分化情況:分化實驗中證實,視網(wǎng)膜干細(xì)胞可以分化為多種不同種類的視網(wǎng)膜細(xì)胞。Realtime PCR結(jié)果顯示ephrinA3基因敲除的視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化后比野

20、生型視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化后表達(dá)更高的感光細(xì)胞標(biāo)記物rhodopsir/和rocovorin,說明ephrinA3基因敲除鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞具有更強(qiáng)的分化潛能。
　　(6)ephrinA3受體分子的研究:RT-PCR證實在視網(wǎng)膜干細(xì)胞內(nèi)EphA4的表達(dá)遠(yuǎn)高于EphA7,免疫沉淀實驗證實在睫狀體上皮細(xì)胞內(nèi)EphA4是ephrinA3的受體分子。免疫組化顯示EphA4表達(dá)在睫狀體上皮上。Western blot結(jié)果證實野生型小鼠的睫狀體上皮組織

21、的EphA4磷酸化程度高于ephrinA3基因敲除鼠的睫狀體上皮組織。證實EphA4是ephrinA3在睫狀體上皮細(xì)胞上的受體。
　　(7)ephrinA3調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖的下游分子通路:加入Wnt3a后,視網(wǎng)膜干細(xì)胞的BrdU摻入百分比明顯升高,Western blot結(jié)果顯示在ephrinA基因敲除鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞原代神經(jīng)球里β-catenin(Wnt3a的下游通道分子)和磷酸化的β-catenin的表達(dá)比野生鼠均有提高,故

22、認(rèn)為而Wng/β-catonin分子通路可能是ephrinA3參與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖的的下游通路。
　　結(jié)論:ephrinA3是小鼠成年視網(wǎng)膜干細(xì)胞龕中的一種內(nèi)源性抑制性分子,它可能通過視網(wǎng)膜干細(xì)胞上的EphA4受體,調(diào)控下游Wng/β-catenin分子通路來抑制視網(wǎng)膜干細(xì)胞的增殖和分化。對ephrinA3的作用及其機(jī)制的了解,為將來調(diào)控體內(nèi)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖和分化,治療臨床疾病方面打下了一定的基礎(chǔ)。下一步將研究敲除遺傳性視網(wǎng)膜