活細(xì)胞中BRCA1蛋白對DNA鏈損傷修復(fù)功能的原位分析.pdf

1、乳腺癌是婦女中最常見的腫瘤之一，在女性腫瘤中占18％，高居女性腫瘤發(fā)生率和死亡率的首位。在我國，乳腺癌的發(fā)生率在逐年增加，因此對乳腺癌相關(guān)基因的研究已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。BRCA1(breastcancersusceptibilitygene1)是遺傳性乳腺癌和卵巢癌的易感基因，其突變與30％～45％的家族性乳腺癌、卵巢癌有關(guān)，而有家族性乳腺癌和卵巢癌家族史的人BRCA1突變率至少為80％。盡管在散發(fā)性乳腺癌中BRCA1基因突變很少見，但

2、在散發(fā)性的乳腺癌和卵巢癌晚期該基因有一定程度的表達(dá)降低。 本文用一種激光系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)波長為405nm的激光在細(xì)胞核原位掃描的次數(shù)，在活的培養(yǎng)細(xì)胞核內(nèi)制造出DNA的急性雙鏈損傷，系統(tǒng)分析了BRCA1在DSBs修復(fù)中的功能。另外通過調(diào)節(jié)波長為365nm的激光的脈沖數(shù)研究了BRCA1對細(xì)胞內(nèi)SSBs的應(yīng)答，我們的實(shí)驗(yàn)為BRCA1功能研究提供了新的視野，為進(jìn)一步闡明BRCA1的致癌機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。 一、材料和方法。 二

3、、GFP融合BRCA1蛋白和各種片斷對于微激光誘導(dǎo)的DNA雙鏈損傷具有應(yīng)答效應(yīng)表明BRCA1的N末端和C末端在DSBs的應(yīng)答中發(fā)揮作用，且兩者分別參與不同的機(jī)制BRCA1由1863個(gè)氨基酸組成，蛋白分子量為220KDa。BRCA1蛋白相對較大，具有多個(gè)重要的結(jié)構(gòu)功能域，其中最重要的為N-末端環(huán)指結(jié)構(gòu)域和BRCA1C-末端還存在著含有兩個(gè)串聯(lián)的BRCT結(jié)構(gòu)域。在我們的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)SBs分別具有應(yīng)答作用。失去BRCA1的N末端

4、和C末端的中間片斷對DNA雙鏈損傷無應(yīng)答，而BRCA1的N末端和C末端分別在DSBs部位形成Foci。BRCA1的N末端和C末端對DSBs應(yīng)答速度和方式的不同提示兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的作用機(jī)制不同。 三、GFP融合BARD1蛋白對激光微掃描后產(chǎn)生的DSBs的也產(chǎn)生應(yīng)答，且其應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)方式與BRCA1野生型的應(yīng)答方式類似，提示著兩種蛋白在體內(nèi)對DSBs修復(fù)有協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)中，我們制作了GFP-BARD1的融合蛋白，無論是否與BRCA1共轉(zhuǎn)染

5、，BARD1都對激光微掃描后產(chǎn)生的DSBs產(chǎn)生應(yīng)答；而與BRCA1共轉(zhuǎn)染的情況下，蛋白表達(dá)更穩(wěn)定，比非共轉(zhuǎn)染僅依靠內(nèi)源性BRCA1的GFP-BARD1產(chǎn)生的Foci強(qiáng)度更強(qiáng)。用Fluoview軟件分析后所得的BARD1產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)與與BRCA1野生型的應(yīng)答方式類似，提示著兩種蛋白在體內(nèi)對DSBs修復(fù)有協(xié)同作用。 四、BRCA1蛋白N末端除了含有RING結(jié)構(gòu)域的區(qū)域?qū)す馕呙韬螽a(chǎn)生的DSBs產(chǎn)生應(yīng)答外，氨基酸101到氨基酸200

6、的片斷也對激光微掃描后產(chǎn)生的DSBs產(chǎn)生應(yīng)答為了檢測BRCA1蛋白N-末端對激光微掃描后產(chǎn)生的DSBs產(chǎn)生應(yīng)答來自于RING結(jié)構(gòu)域的作用，我們制作了BRCA1N-末端的六個(gè)小的蛋白片斷。結(jié)果不僅含有RING結(jié)構(gòu)域的氨基酸1-100、氨基酸1-200、氨基酸1-300蛋白片斷對DSBs產(chǎn)生應(yīng)答，不含有RING結(jié)構(gòu)域的氨基酸101-200和氨基酸101-300蛋白片斷也對DSBs產(chǎn)生應(yīng)答，僅氨基酸201-300對DSBs無應(yīng)答，提示氨基酸1

7、01-200含有重要的結(jié)構(gòu)域或該區(qū)域能夠與重要的修復(fù)蛋白發(fā)生相互作用。 五、BRCA1蛋白氨基酸101到氨基酸200間的4個(gè)腫瘤患者由來的點(diǎn)突變降低了N末端對激光微掃描后產(chǎn)生的DSBs產(chǎn)生應(yīng)答的能力根據(jù)乳腺癌信息中心BCI記載，Y105E，P142H，P143K和E179C是4個(gè)在腫瘤患者中發(fā)生頻率較高的點(diǎn)突變。目前對這4種點(diǎn)突變，尚無人對其所導(dǎo)致的致癌機(jī)理進(jìn)行分析。東北大學(xué)加齡研究所癌化學(xué)療法研究分野的千葉先生在美國制作了含有

8、這4種突變的8種表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)過微激光原位掃描，我們發(fā)現(xiàn)含有這4種突變的8種蛋白對產(chǎn)生的DSBs都能產(chǎn)生應(yīng)答，含有突變的蛋白對DSBs都能產(chǎn)生應(yīng)答形成Foci的強(qiáng)度均低于相應(yīng)的野生型蛋白，特別是點(diǎn)突變P142H，這可能與這些點(diǎn)突變引起腫瘤的機(jī)制相關(guān)。這些蛋白其蛋白表達(dá)水平均基本與野生型蛋白表達(dá)水平一致。 BRCA1蛋白氨基酸101到氨基酸200片斷對激光微掃描后產(chǎn)生的DS-Bs應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)方式與BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸100

9、和BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸200相似，由于核心的環(huán)指結(jié)構(gòu)域位于氨基酸24到氨基酸64之間，與BARD1相互作用，因此我們猜想BRCA1蛋白氨基酸101到氨基酸200片斷是否同樣與BARD1相互作用。我們用抗GFP抗體作IP，來沉降FLAG-BARD1蛋白，Western-blotting分別用抗BARD1抗體和抗GFP抗體檢測，BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸100和BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸200與BARD1存在相互作用，然而

10、，BRCA1蛋白氨基酸101到氨基酸200片斷與BARD1并不存在相互作用。比較分別與BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸100和BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸200共轉(zhuǎn)染的BARD1的表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸200共轉(zhuǎn)染的BARD1的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于與BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸100共轉(zhuǎn)染的量，這也就提示了，BRCA1蛋白氨基酸101到氨基酸200部位與其他重要的蛋白存在相互作用，從而影響了氨基酸1到氨基酸100部位

11、與BARD1的結(jié)合。然而這個(gè)重要的結(jié)合蛋白是什么，尚不清楚，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。 六、對于BRCA1蛋白的磷酸化，ATM蛋白不是唯一的激酶，NBS1蛋白影響B(tài)RCA1蛋白C-末端對DSBs的應(yīng)答，而Ku80蛋白影響B(tài)RCA1蛋白N-末端對DSBs的應(yīng)答B(yǎng)RCA1在ATM欠損細(xì)胞和H2AX欠損細(xì)胞中內(nèi)，全長和各個(gè)片斷均對DSBs產(chǎn)生應(yīng)答，也就是說BRCA1對DSBs產(chǎn)生應(yīng)答并不依賴于這兩種蛋白，這也與之前的報(bào)道相一致。BRCA1全

12、長和D775-1292以及N-末端在NBS1欠損細(xì)胞中均對DSBs產(chǎn)生應(yīng)答，而BRCA1的BRCT結(jié)構(gòu)域區(qū)在該細(xì)胞中對DSBs不應(yīng)答。這就提示了BRCA1的BRCT結(jié)構(gòu)域?qū)SBs的應(yīng)答作用具有NBS1依存性。BRCA1的這兩個(gè)高度保守區(qū)域在DNA-PKcs蛋白野生型和欠損型的細(xì)胞中對微激光掃描后所造成的DSBs都產(chǎn)生應(yīng)答；BRCA1的C-末端在Ku80蛋白野生型和欠損型的細(xì)胞中對微激光掃描后所造成的DSBs都產(chǎn)生應(yīng)答，而BRCA1的N

13、-末端在Ku80蛋白欠損型的細(xì)胞中對微激光掃描后所造成的DSBs失去應(yīng)答。 七、外源性BRCA對DNA單鏈損傷產(chǎn)生修復(fù)應(yīng)答，且僅C末端對這種應(yīng)答有重要意義在本實(shí)驗(yàn)中就是主要用365nm激光、F20、一次脈沖來制造DNA單鏈損傷。GFP融合BRCA1蛋白片斷經(jīng)過Western-blotting證實(shí)了蛋白活性。不同于掃描式激光所造成的現(xiàn)狀損傷，用脈沖式激光制造的損傷呈現(xiàn)點(diǎn)狀損傷，用Olympus共聚焦熒光顯微鏡可在損傷形成后連續(xù)動(dòng)態(tài)

14、的觀察細(xì)胞中所想研究的GFP融合蛋白應(yīng)答情況。不同于BRCA1對DSBs的應(yīng)答，僅僅失去BRCA1的C末端的片斷對就對DNA單鏈損傷無應(yīng)答，當(dāng)然BRCA1無N末端和C末端的中間段也沒有應(yīng)答，而單純的BRCA1的C末端就能夠在SSBs部位形成Foci。 八、內(nèi)源性BRCA對DNA單鏈損傷也產(chǎn)生修復(fù)應(yīng)答在XPA-UVDE的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中我們加入了ActinomycinD的步驟。在紫外線照射前加入ActinomycinD的XPA-Vect

15、or細(xì)胞中紫外線損傷修復(fù)經(jīng)路被抑制，而又沒有形成SSBs，因此BRCA1沒有形成Foci；在加入Acti-nomycinD的XPA-UVDE細(xì)胞中雖然紫外線損傷修復(fù)經(jīng)路被抑制，但是由于UVDE的作用在紫外線損傷部位產(chǎn)生大量的SSBs，BRCA1在這些部位形成了Foci，這一結(jié)果和外源性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，進(jìn)一步證明了BRCA1對SSBs具有應(yīng)答效應(yīng)。 九、BRCA對DNA單鏈損傷產(chǎn)生修復(fù)應(yīng)答的生理學(xué)意義我們用siRNA的方法，在H

16、eLa細(xì)胞中敲除BRCA1蛋白的表達(dá)，這樣的HeLa細(xì)胞對產(chǎn)生SSBs的烷化類試劑MMS敏感性增強(qiáng)。這就提示BRCA1在細(xì)胞內(nèi)對SSBs具有一定的修復(fù)功能，當(dāng)缺失時(shí)就會引起細(xì)胞表型的改變。HCC1937是乳腺癌患者來源的細(xì)胞，在這個(gè)細(xì)胞中基因組BRCA1的3末端存在引起翻譯提前終止的點(diǎn)突變，從而翻譯出C-末端缺失的BRCA1蛋白。由于HCC1937BRCA1失去了對SSBs產(chǎn)生應(yīng)答的最重要的結(jié)構(gòu)域部分，因此如預(yù)計(jì)的那樣，細(xì)胞本身對MMS