電場刺激下皮層神經細胞內dcc分子基因表達的研究

1、<p>　　單位代碼 10006 </p><p>　　學 號 10101008 </p><p>　　分類號 </p><p>　　密 級 秘 密 </p><p><b>　　畢業(yè)設計(論文)</b><

2、;/p><p>　　電場刺激下皮層神經細胞內DCC分子基因表達的研究</p><p><b>　　2014年5月</b></p><p><b>　　北京航空航天大學</b></p><p>　　本科生畢業(yè)設計（論文）任務書</p><p>　?、?、畢業(yè)設計（論文）題目：<

3、/p><p>　　電場刺激下皮層神經細胞內DCC分子基因表達的研究 </p><p>　?、?、畢業(yè)設計（論文）使用的原始資料（數(shù)據(jù)）及設計技術要求：</p><p>　　本實驗研究在文獻調研的基礎上，發(fā)現(xiàn)神經導向生長分子Netrin-1能夠有效

4、地與其受體DCC結合，以促進神經突起的導向延伸。但是，外加電場對神經導向生長的研究尚未見報道。本研究擬采用不同條件的電場刺激，檢測原代培養(yǎng)的皮層神經元內受體DCC的表達，通過免疫熒光檢測電刺激后神經突起的延伸生長情況，RT-PCR對DCC基因mRNA表達水平進行檢測。設計技術要求包括大鼠皮層神經細胞的分離與原代培養(yǎng)、細胞電場加載實驗、免疫熒光檢測、RT-PCR技術。

5、 </p><p>　?、?、畢業(yè)設計（論文）工作內容：</p><p>　　工作內容主要包括三個方面：1、大鼠皮層神經細胞的原代培養(yǎng)：采用原代培養(yǎng)技術，對出生當天的新生SD大鼠乳鼠進行大腦皮層神經細胞的分離培養(yǎng)和鑒定。2、電場加載實驗：采用電場刺激儀，利用鉑電極對培養(yǎng)的細胞進行電刺激，分別檢測0mv, 50mv，100mv作用2h、4

6、h后，觀察細胞的形態(tài)變化。刺激后的細胞，進行多聚甲醛固定后，采用免疫熒光技術，檢測β-tublin III，觀察神經突起的延伸變化。3、RT-PCR檢測DCC分子：對刺激后的細胞進行Trizol裂解后再RNA提取，對DCC分子基因進行RT-PCR擴增，檢測其基因表達水平。 </p><p><

7、;b>　?、?、主要參考資料：</b></p><p>　　1、Rajasekharan S, Baker KA, Horn KE, Jarjour AA, Antel JP, Kennedy TE: Netrin 1 and Dcc regulate oligodendrocyte process branching and membrane extension via Fyn and RhoA

8、. Development 2009, 136(3):415-426. </p><p>　　2、Kim, T. H., Lee, H. K., Seo, I. A., Bae, H. R., Suh, D. J., Wu, J., Rao, Y., Hwan

9、g, K. G. and Park, H. T. (2005) Netrin induces down-regulation of its receptor, Deleted in Colorectal Cancer, through the ubiquitin-proteasome pathway in the embryonic cortical neuron. J Neurochem, 95, 1-8.

10、 </p><p>　　3、Li, X., Gao, X., Liu, G., Xiong, W., Wu, J. and Rao, Y. (2008)

11、Netrin signal transduction and the guanine nucleotide exchange factor DOCK180 in attractive signaling. Nat Neurosci, 11, 28-35. </p><p&

12、gt;　　4、Norman, L. L., Stroka, K. and Aranda-Espinoza, H. (2009) Guiding axons in the central nervous system: a tissue engineering approach. Tissue Eng Part B Rev, 15, 291-305.

13、 </p><p>　　5、Smith, D. H. (2009) Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol, 89, 231-239. </p><p>　　6、Rajasekharan S,

14、 Bin JM, Antel JP, Kennedy TE: A central role for RhoA during oligodendroglial maturation in the switch from netrin-1-mediated chemorepulsion to process elaboration. J Neurochem 2010, 113(6):1589-1597. </p><

15、p>　　7、Abigail N Koppes, Angela M Seggio and Deanna M Thompson. Neurite outgrowth is significantly increased by the simultaneous presentation of Schwann cells and moderate exogenous electric fields.2011, J. Neural Eng.

16、 8, 046023 (13pp).</p><p>　　生物與醫(yī)學工程 學院（系） 生物工程 專業(yè)類 101011 班</p><p>　　學生 陽雨辰 </p><p>　　畢業(yè)設計（論文）時間： 2014 年 3 月 7 日至 2014 年 6月10日</p><p>　　答辯時間： 年 月

17、 日</p><p>　　成 績： </p><p>　　指導教師： </p><p>　　兼職教師或答疑教師（并指出所負責部分）：</p><p>　　系（教研室） 主任（簽字）： </p><p>　　注：任務書應

18、該附在已完成的畢業(yè)設計（論文）的首頁。</p><p><b>　　本人聲明</b></p><p>　　我聲明，本論文及其研究工作是由本人在導師指導下獨立完成的，在完成論文時所利用的一切資料均已在參考文獻中列出。</p><p><b>　　作者：陽雨辰</b></p><p><b>

19、　　簽字：</b></p><p>　　時間：2014年 5 月</p><p>　　電場刺激下皮層神經細胞內DCC分子基因表達的研究</p><p>　　學 生：陽雨辰</p><p><b>　　指導老師：劉美麗</b></p><p><b>　　摘要</b

20、></p><p>　　目的 根據(jù)建立的新生SD大鼠皮層神經元原代體外培養(yǎng)的方法培養(yǎng)皮層神經元，并對培養(yǎng)成熟的神經元做免疫熒光染色，以鑒定所培養(yǎng)的神經元。對所培養(yǎng)的神經元在不同電壓下加載不同時間，明確不同條件電場刺激下神經導向分子受體DCC分子的基因表達水平。為研究電場與神經導向生長的分子機制奠定基礎。方法 對體外培養(yǎng)的皮層神經元在電壓為50mV、100mV條件下分別加載2h和4h，并對電場加載的神經元進

21、行Tubulin-Ⅲ免疫熒光染色觀察神經元在不同電場條件下的形態(tài)變化以及軸突長度的變化；以及通過RT-PCR以及Realtime PCR獲取DCC分子的基因表達情況，確定DCC分子基因表達的最佳條件，為后續(xù)神經導向生長機制提供依據(jù)。結果 原代皮層神經元在體外培養(yǎng)情況下，7天可達最好細胞狀態(tài)。電場刺激下神經元的軸突長度都有顯著性地增加，DCC分子在電壓為50mV條件下加載4h基因表達顯著增加。結論 成功體外培養(yǎng)原代皮層神經元，初步確定了D

22、CC分子基因表達最佳的電場刺激條件，具有一定實際意義和應用價值。</p><p>　　關鍵詞：神經細胞的原代培養(yǎng)、電場加載、免疫熒光染色、DCC受體、RT-PCR</p><p>　　DCC Gene Expression in Cortical Neuron in the condition of Electrical Stimulation</p><p>　　

23、Author: YANG Yu-chen</p><p>　　Tutor: LIU Mei-li</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Objective: Electrical stimulation can promote axonal outgrowth, but its mechanism is no

24、t clear yet. In this study, the axonal guidance growth cues Netrin-1 receptor DCC (Deleted in Colorectal Cancer) was investigated by RT-PCR assay after electrical stimulation. Methods: rat cortical neurons were primary c

25、ultured here, then cortical neurons were identified by IF (immuno-fluorescence) assay with mouse anti-β Tubulin-Ⅲ antibody. Primary cultured cortical neurons were subjected to electrical stimul</p><p>　　Key

26、words: Primary Cultured cortical neuron, Electrical stimulation, IF, DCC, RT-PCR</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　1緒論1</b></p><p><b>　　1.1 概述1</b&g

27、t;</p><p>　　1.1.1 神經系統(tǒng)的功能與組成1</p><p>　　1.1.2 神經細胞培養(yǎng)1</p><p>　　1.1.3 神經細胞鑒定的主要方法2</p><p>　　1.2 課題背景3</p><p>　　1.2.1 神經損傷及修復3</p><p>　　1.2.

28、2 神經導向生長5</p><p>　　1.3 研究目的8</p><p>　　1.4 論文構成及研究內容8</p><p>　　2實驗材料和方法10</p><p>　　2.1 實驗材料與設備10</p><p>　　2.1.1 實驗藥品10</p><p>　　2.1.2 實驗

29、器材10</p><p>　　2.1.3 實驗動物10</p><p>　　2.2 大鼠皮層神經細胞原代培養(yǎng)10</p><p>　　2.2.1 手術器械的高壓消毒10</p><p>　　2.2.2 DMEM高糖培養(yǎng)基過濾滅菌11</p><p>　　2.2.3 細胞培養(yǎng)流程11</p>&

30、lt;p>　　2.3 電場加載實驗12</p><p>　　2.4 免疫熒光染色12</p><p>　　2.4.1 準備細胞12</p><p>　　2.4.2 染色流程12</p><p>　　2.5 FDA（Fluorescein diacetate 乙酰熒光素）染色13</p><p>　　2.

31、5.1 配制染色所需的試劑13</p><p>　　2.5.2 染色步驟13</p><p>　　2.6 RT-PCR檢測DCC分子14</p><p>　　2.6.1 總RNA的提取14</p><p>　　2.6.2 反轉錄合成cDNA15</p><p>　　2.6.3 PCR反應16</p&g

32、t;<p>　　2.6.4 DNA電泳檢測16</p><p>　　2.7 Realtime PCR檢測DCC分子基因表達17</p><p>　　3實驗結果與討論18</p><p>　　3.1 神經細胞原代培養(yǎng)18</p><p>　　3.1.1 培養(yǎng)初期神經細胞18</p><p>　　

33、3.1.2 培養(yǎng)中期神經細胞18</p><p>　　3.1.3 培養(yǎng)后期神經細胞19</p><p>　　3.2 神經元染色結果19</p><p>　　3.2.1 Tubulin-Ⅲ免疫熒光染色20</p><p>　　3.2.2 DAPI核染以及疊加結果22</p><p>　　3.2.3 FDA染色結

34、果24</p><p>　　3.2.4 不同電刺激電壓及刺激時間條件下神經元軸突長度變化24</p><p>　　3.3 RT-PCR檢測DCC分子基因表達25</p><p>　　3.3.1 所有實驗組RT-PCR結果25</p><p>　　3.3.2 RT-PCR灰度值統(tǒng)計結果25</p><p>　　

35、3.4 Real time PCR檢測DCC分子基因表達結果28</p><p>　　4結論與展望29</p><p><b>　　致謝31</b></p><p><b>　　參考文獻32</b></p><p><b>　　緒論</b></p>&l

36、t;p><b>　　概述</b></p><p>　　神經系統(tǒng)的功能與組成</p><p>　　神經系統(tǒng)(nervous system)在機體內起主導作用。人體是一個復雜的機體，各器官、系統(tǒng)的功能不是孤立的，它們之間互相聯(lián)系、互相制約；同時，人是生活在一個環(huán)境多變的條件中，環(huán)境的變化隨時影響著體內的各種功能。這就需要對體內各種功能的實現(xiàn)進行有效的調節(jié)，使機體適應

37、內外環(huán)境的變化，神經系統(tǒng)就能實現(xiàn)這一調節(jié)功能。機體內部和外部環(huán)境的各種信息（尤其是電場的刺激），由感受器接受后，通過周圍神經中樞和各級中樞進行整合，以維持機體與內部和外部環(huán)境的相對平衡。神經系統(tǒng)細胞包括神經元、神經膠質細胞以及神經突觸。</p><p>　?。?）神經元 神經元(neuron)是一種高度特化的細胞，它能感受刺激并且傳導興奮。神經元由胞體和突觸這兩個部分構成。神經元突觸根據(jù)形狀和機能可以分為

38、樹突(dendrite)和軸突(axon)。樹突較短但分支較多，并且各類神經元樹突的數(shù)目不等，形態(tài)也各不相同。每個神經元只發(fā)出一條軸突而軸突的長短是不一樣的，神經元發(fā)生的電信號則沿軸突傳出。 根據(jù)突起的數(shù)目，可將神經元從形態(tài)上分為假單極神經元、雙極神經元和多極神經元[2]三大類[1] 。 （2）神經膠質細胞 神經膠質細胞(neuroglia)的數(shù)目是神經元10~50倍[3] ，膠質細胞的突起沒有樹突和軸突的分別，胞體比較小，胞

39、漿中沒有神經原纖維和尼氏體而且它也不具有傳導神經沖動的功能。神經膠質對神經元胞體起著營養(yǎng)保護和支持絕緣的作用，并且參與血腦屏障的構成[2] 。 （3）神經突觸 突觸就是神經元之間互相接觸的方式，因為神經元間不是細胞質的互相溝通。突觸通常是一個神經元的軸突與另一個神經元的樹突借其發(fā)生聯(lián)系，神經的電信號是由一個神經元通過突觸傳遞到另一個神經元的。</p><p>　　神經細胞培養(yǎng)主要材料</p>

40、;<p>　　神經細胞的原代培養(yǎng)被認為比那些在體外多次傳代的神經細胞株更能代表體內的神經細胞的正常發(fā)育狀態(tài)[13] 。國內從60 年代開始已有人[14,15] 培養(yǎng)腦神經細胞。</p><p>　　而由于神經細胞是一種高度分化的細胞，在動物出生后很少分裂；而且神經元分化程度高，神經突起發(fā)育成熟，從成熟神經組織分離神經元，會使神經元受到更大的普遍損傷，因此對神經元進行分離培養(yǎng)的要求較為特殊，難度也較大

41、。傳統(tǒng)的神經元原代培養(yǎng)使用的實驗材料均為胎鼠[16-18] ，用新生鼠的較少[19] 。</p><p>　　這是由于鼠類的神經元和神經膠質細胞在出生時都沒有分化成熟，這種細胞具有比較強的適應環(huán)境的能力，更易成活。臨產(21d) 的胚胎和新生動物[20]是最好的腦細胞培養(yǎng)物的選擇。新生鼠和胚胎鼠是不同的，它的神經元的分化程度更高一些，神經突起發(fā)育更加成熟，神經元和神經元之間以及神經元和纖維組織之間的連接都要更加緊

42、密，在實驗操作的消化過程中更容易造成損傷[21] ，由于取材于新生鼠的腦組織的神經元細胞原代培養(yǎng)的成功率比較低，目前國內外傳統(tǒng)的神經元原代培養(yǎng)所使用的實驗材料都是胚胎鼠，使用較少的新生鼠。然而，用胚胎鼠做實驗材料的缺點不僅在于耗資大，還在于孕鼠的孕期比較難以控制，因此近年來多用新生鼠代替胎鼠進行神經元原代培養(yǎng)。</p><p>　　神經細胞鑒定的主要方法</p><p>　?。?）免疫細胞

43、化學技術</p><p>　　在體外培養(yǎng)環(huán)境下，神經細胞的形態(tài)變化極大。目前通常采用的神經元鑒定方法為免疫染色方法。</p><p>　　免疫細胞化學技術是利用特異性抗體顯示組織或細胞化學成分（抗原）的技術。其優(yōu)點在于能夠對細胞的某種或者某些化學成分進行特異性的顯示。免疫細胞化學方法包括固定，制片和反應三個基本步驟[22] 。</p><p>　　免疫酶組織化學采用

44、酶標記的抗體直接或者通過特異性抗體間接地與組織中的抗原結合，然后用酶的特異性底物以及顯色系統(tǒng)來顯示抗原存在的部位。最常用來標記抗體的酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。HRP的底物及顯色系統(tǒng)通常用過氧化氫-二氨基苯胺，而AP的底物及顯色系統(tǒng)一般用磷酸萘酯-偶氮染料。該方法的突出優(yōu)點是能夠較好地顯示細胞輪廓，特別是經過適當稱染之后，陽性信號定位更明確[23] 。免疫酶組織化學染色標本經過封固后可以較長時間保存，便于進行回顧性

45、研究。該方法的主要缺點是反應步驟相對繁雜，因涉及酶促反應，反應條件相對苛刻，對顯色控制的技術要求較高。</p><p>　　免疫熒光組織化學采用熒光物質標記抗體來顯示抗原存在部位。最常用來標記抗體的熒光物質有異硫氰酸熒光素（FITC），四甲基異硫氰酸羅達明（TRITC），德克薩斯紅(TR)[24] 。免疫熒光組織化學反應后，以一定波長的光進行激發(fā)，抗原存在部分發(fā)出特定波長的熒光，利用熒光顯微鏡進行觀察和攝影。其有

46、點是比較簡便和快捷，而主要缺點是熒光容易淬滅，需及時進行觀察和攝影，染色標本不能長時間保存。</p><p>　　常用的神經細胞標志性物質列舉如下：</p><p>　　NSE，神經元型烯醇化酶。</p><p>　　Tubulin，微管蛋白。</p><p>　　MAP2(Microtubule-associated Protein 2)，

47、微管相關蛋白2。</p><p>　　膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，星形膠質細胞的特異性標志蛋白。</p><p>　　NF即神經中絲，是神經元特異的標志物，主要分布在胞漿，尤以突起的起始部為多。</p><p>　　nestin（巢蛋白）：神經巢蛋白，是最大的中間絲蛋白，分子量為210-240KDa，nestin劃分為Ⅵ類中間絲，是神經干細胞的一種特異性標志物，在

48、胚胎時期的神經干細胞和未成熟的星形膠質細胞中表達，出生后在成熟的星形膠質細胞中消失，但在活動性星形膠質細胞會重新出現(xiàn)。成熟的CNS中不表達nestin。</p><p>　?。?）DAPI染核技術</p><p>　　DAPI染色原理：DAPI（4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚）與DNA雙螺旋的凹槽部分可以發(fā)生相互作用，從而與DNA的雙鏈緊密結合。且結合后可以產生比DAPI自身強20多倍的熒光[

49、25]。用熒光顯微鏡進行觀察時，DAPI染液是用紫外光波長的光進行激發(fā)。當DAPI和雙鏈DNA結合時，吸收波長的最高峰在358 nm處，發(fā)射波長的最高峰在461 nm處，而它光的波長范圍是包括從藍色到青綠色這一大段。DAPI不僅可以喝雙鏈DNA結合，它也可以和RNA結合，但它與RNA結合時產生的熒光強度沒有它與DNA結合時的強度高，它的光波長范圍約在400 nm附近，呈現(xiàn)的是藍色[26] 。</p><p>&l

50、t;b>　　課題背景</b></p><p><b>　　神經損傷及修復</b></p><p><b>　　1、概述</b></p><p>　　神經系統(tǒng)在機體的正常生命活動中扮演了重要角色。機體內各器官組織間的協(xié)調以及機體對外界環(huán)境的變化作出反應都需要神經系統(tǒng)的參與。神經系統(tǒng)損傷可能會造成感覺、運動功

51、能的喪失甚至意識和行為的改變，這可能會對傷員的生活自理能力造成影響也會對傷員家庭以及社會帶來比較大的負擔[27]，所以神經損傷的修復就更加重要了。神經損傷不僅傷害性大，它在各種自然災害以及意外事故中也非常常見。在細胞層面，神經損傷主要表現(xiàn)為神經元的喪失或神經纖維受損[27]；在組織器官層面，神經損傷可以表現(xiàn)為骨骼肌功能喪失甚至萎縮[28]以及部分器官無法對神經調控進行反應繼而喪失功能，進而造成人體生理調控紊亂而帶來嚴重后果。</p

52、><p>　　神經損傷的修復在微觀層面需要神經細胞和神經纖維的再生，以及新生的神經細胞向損傷部位的遷移[27]，并且受損處的神經細胞需要與適當?shù)陌袠私⑼挥|聯(lián)系，以此恢復其功能。但是這個過程卻會因為髓磷脂的抑制作用、神經元細胞死亡以及損傷處缺少合適的基質而變得困難[28-31]。同時，神經修復也會受到環(huán)境因素的影響，如：神經膠質細胞和神經營養(yǎng)因子的參與、損傷處表面形貌以及外部的生物物理環(huán)境因素等[33]。于是我們需要

53、尋找能有效促進神經損傷修復的辦法。</p><p><b>　　2、主要方法</b></p><p>　　神經損傷修復對神經損傷病人生活自理、減輕疾病痛苦以及恢復正常生理功能都是非常重要的。傳統(tǒng)的神經損傷修復可以歸納為兩個主要的方式：一種是直接修復受損處，以自體修復或者移植的方式實現(xiàn)損傷的愈合。這種方式在臨床多采用外科損傷修復技術，包括神經斷端縫合修復和軸索修復。神經

54、斷端縫合修復即采用外科縫合的方法把斷裂的神經重新縫合在一起，其中無縫縫合技術受到越來越多的重視，因為它可以有效減少瘢痕的出現(xiàn)[27]。除外科損傷修復以外，神經的自體移植以及神經組織工程也為神經損傷修復帶來了新的力量；另一種是間接修復損傷，以減緩對神經再生抑制的方法實現(xiàn)損傷處細胞的再生以實現(xiàn)損傷修復。這種方式主要表現(xiàn)為通過基因工程的方法向細胞中導入促進神經生長的細胞因子[34]或是導入阻抑nogo蛋白的基因[35]，以此促進神經細胞的生長

55、。</p><p>　　干細胞為神經損傷修復注入了新鮮的血液。神經干細胞已經在臨床應用，并且取得了一定的療效。但是它仍有很多缺陷，如：干細胞來源有限，無法大量應用于臨床治療；干細胞在局部的存活率較低，應用的有效性不夠；臨床上對干細胞在損傷處發(fā)揮的作用檢測機制不完善，無法判斷干細胞是否發(fā)揮了神經元的作用等[27]。</p><p>　　電場對神經的影響已經有了大量的闡述。早在1982年，Ba

56、ker等[36]在傷口修復以及神經發(fā)育的體內實驗中發(fā)現(xiàn)神經細胞及其支持細胞如施旺氏細胞都存在于穩(wěn)定的電場梯度中，而該電場強度就在40-140mV/mm的范圍內。而神經元在體外電場環(huán)境中會表現(xiàn)出不一樣的特征：陰極趨向性[37]、陽極趨向性[38]、神經軸分支增加[39]、神經發(fā)生增加[40]或者沒有反應[41]。由此，電場對神經損傷修復也有了大量的研究。臨床上，電刺激對周圍神經的功能康復有比較好的效果。不同頻率的電刺激對周圍神經的作用也是

57、不一樣的，低頻可誘導施旺氏細胞增殖以及髓鞘的修復[42]；中頻可提高疼痛閾值，減輕疼痛感；高頻可改善損傷區(qū)的血液循環(huán)以促進修復[43]。另外，對脊髓損傷動物模型施加外加直流電場（200mV/mm）發(fā)現(xiàn)，脊髓血流量、誘發(fā)電位以及脊髓的功能都有了較大的改善[44]。電場對神經元的遷移也有很重要的作用。Yao等[45]研究發(fā)現(xiàn)大鼠海馬體細胞內的細胞器會在電場作用下發(fā)生不對稱分布，從而導致細胞的不對稱分布。Jaffe和Poo[46]發(fā)現(xiàn)雞背側神

58、經節(jié)外植體在穩(wěn)定的dc電場中會表現(xiàn)出電場不同極性的遷移。但是電場</p><p><b>　　神經導向生長</b></p><p><b>　　1、概述</b></p><p>　　大腦內的信息傳遞過程從很大程度上是由內部神經連接網(wǎng)絡決定的。中央神經系統(tǒng)（CNS）中神經元的連接程度是十分驚人的。成人腦中每1012個神經元平

59、均與1000個靶細胞相連，因此形成了一個特定的回路，這個回路模式是否正確對神經系統(tǒng)功能是否正確非常重要。</p><p>　　在神經系統(tǒng)整體形態(tài)形成的過程中，神經元在特定的區(qū)域產生，然后通過特定的途徑進行轉移，直到到達其目的地。每一個神經元形成一組表現(xiàn)其表現(xiàn)型的樹突以及延伸以形成特定途徑到達其突觸靶標的神經軸[48]。這個過程即為神經軸的導向生長。</p><p>　　神經軸的導向生長需要

60、其與基質的粘附作用以及引導信號提供的方向相關的信息。粘附受體將胞外基質的信號傳導給細胞骨架，因此給生長椎的移動提供了必須的牽引力，同時引導信號在與粘附受體吸引和排斥的過程中為其提供了方向的信息[49-52]。然而，因為粘附分子也可以提供方向信息修改引導信號提供的信息，所以吸引和排斥并不能嚴格地區(qū)分出來[51-55]。生長椎將提供的信號整合并且做出反應，而這反應則通過細胞骨架的重排表現(xiàn)出來[51,52,55]。這些反應的本質更多體現(xiàn)在生長

61、椎的功能特性上，而非體現(xiàn)在識別信號本身。</p><p>　　神經軸導向生長的機制與白細胞的趨藥性以及阿米巴變形蟲的運動非常相似，成神經細胞以及神經軸在胚胎“環(huán)境”中通過特定細胞結構如神經軸生長椎以及遷移神經元導向區(qū)域的形成受到周圍信號引導以“探究”周邊環(huán)境[64]。周圍的分子表現(xiàn)出吸引或者排斥的不同信號，生長椎會對這些信號進行整合并作出反應。對吸引信號，生長椎可能表現(xiàn)為神經生長或者發(fā)生牽引作用，對排斥信號，生長

62、椎可能表現(xiàn)為生長椎的崩塌和回縮。</p><p><b>　　2、主要的導向分子</b></p><p>　　許多分子參與到這種導向中，包括生長促進因子、細胞粘附因子（CAMs）以及胞外基質分子（ECMs）。除了這些分子，在基因、生化以及分子途徑中也發(fā)現(xiàn)了四種保守家族引導信號分子：神經生長因子（netrins）、裂縫蛋白（Slits）、腦信號蛋白以及Eph配體。其中一

63、種或者幾種的受體也被發(fā)現(xiàn)了，包括結直腸癌缺失DCC（Unc40）與UNC-5、Robo、神經纖維網(wǎng)格蛋白、叢狀蛋白以及Ephs[65]。</p><p>　?。?）Netrin家族及其受體</p><p>　　R.y. Cajal[62]發(fā)現(xiàn)作為基礎神經軸導向機制的化學誘導分子：Netrin，最初它被描述為“導向的分子”。有研究表明，Netrins無論在胚胎CNS發(fā)育過程中還是CNS損傷修

64、復中都是廣泛存在的神經誘向因子[63]。大多數(shù)Netrin家族成員是可以控制神經元和生長椎遷移的分泌蛋白[64]。這些蛋白是雙功能信號分子，其中一些是神經元的化學誘導因子，一些是神經元的化學抑制因子。Netrins通過與兩個蛋白家族DCC以及UNC-5中的特定蛋白相互作用以發(fā)揮其功能。DCC/UNC-40既可以調節(jié)吸引反應，也可以調節(jié)拮抗反應，然而UNC-5僅發(fā)現(xiàn)可以調節(jié)拮抗反應[65,66]。哺乳動物研究表明DCC自身可以調節(jié)吸引作用

65、，而DCC和UNC-5一同可以調節(jié)拮抗作用[67]。對蠕蟲的神經研究表明DCC和UNC-5單獨作用也可以調節(jié)拮抗作用[68]。對果蠅的研究表明UNC-5單獨作用可調節(jié)短程拮抗作用，然而UNC-5和DCC一起可以調節(jié)長距離的拮抗作用[69]。Netrin-1通過DCC激活Cdc42和Rac1，并且通過Cdc42形成絲狀偽足，在HEK293細胞和神經節(jié)膠質細胞系NG108-15中</p><p>　?。?）Semap

66、horins家族</p><p>　　Semaphorins導向蛋白家族是一類或為分泌型或為跨膜型的糖蛋白,它們的N 端都含有 532個氨基酸殘基組成的- sema區(qū)保守序列。該家族成員中 Semaphorin-1和 collapsin-1最早被發(fā)現(xiàn)。 Sema I是一種跨膜蛋白，它在蚱蜢的胚胎發(fā)育中起到了引導周邊神經軸突生長的作用[56]。鼠和人的Sema III是研究較多的分泌型信號素，它們在脊髓腹側（除底伴

67、外）的細胞和大腦中都有高水平的表達 。</p><p>　　Semaphorins導向蛋白家族最早是發(fā)現(xiàn)它的功能與軸突有關，該蛋白家族可以影響軸突的拉伸與收縮、分枝、導向生長以及突觸形成的過程。軸突發(fā)育的不同層面上會有不同的 Semaphorin蛋白發(fā)揮作用，并且該蛋白的作用常常是高度特異的負調節(jié)。除了神經系統(tǒng)發(fā)育方面該蛋白家族會發(fā)揮作用外，研究表明SemaIII還可以在幾種不同組織的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并且該蛋

68、白在發(fā)育過程中還可作為心臟發(fā)育的的生長調節(jié)因子[57,58]。</p><p>　?。?）Ephrins家族</p><p>　　Slit分子是發(fā)現(xiàn)的第一種對神經生長以及神經元遷移均有導向作用的分子[59,60]。Slits是發(fā)育期脊髓中線膠質細胞以及中隔組織分泌的一組相對分子量為170-190KD的分泌型蛋白質[59]。Slit分子對軸突生長起到了排斥性的導向生長作用。神經中線細胞所分泌

69、的作為排斥信號的導向生長分子Slits蛋白會和表達在這些軸突表面的受體相互作用，這種相互作用可以決定這些軸突是否穿過中線，從而阻止已經穿過中線的軸突再次返回中線而發(fā)生中線的來回穿越現(xiàn)象 [61]。Slit分子也可促進其背根神經節(jié)軸突的延伸和分支的過程，同時它還可以抑制化學趨向因子驅使的白細胞的運動。</p><p>　　3、電場與導向生長的關系</p><p>　　研究電場對神經細胞的影響

70、可以給神經損傷的修復提供理論和方法上的支持。從現(xiàn)在的研究上看，在神經修復的過程中，加載電場刺激可以促進人工移植的神經突起導向延伸。神經損傷后，軸突會斷裂，如果電場刺激能促進軸突的延伸和正確導向連接，那么對損傷后的神經再生將具有重大意義。但是電場刺激對神經突起的導向生長機制還不明確，因此研究電場刺激對神經細胞導向生長的影響十分重要。神經軸的導向生長與其生長椎密切相關，生長椎的延伸方向決定了神經軸延伸的方向。許多化學分子會參與到神經細胞的遷

71、移過程中，神經導向分子（Netrin）是其中非常重要的一種化學分子。這種分子能吸引或排斥神經軸生長椎，從而引導生長椎的生長方向。然而Netrin對生長椎的引導作用的實現(xiàn)需要其受體的存在，結腸癌缺失（DCC）是Netrin的一個非常重要的受體，它能與Netrin相互作用，參與神經軸的形成，引導神經軸的導向生長。因此對電場刺激的大腦皮層細胞進行DCC分子表達檢測就能從一定程度上檢測出大腦皮層細胞在電場的作用下其神經軸的導向生長情況，為神經損

72、傷修復提供理論基礎。</p><p>　　神經損傷修復需要神經元的再生、神經元朝向損傷處的遷移以及損傷區(qū)域神經軸與靶標之間建立聯(lián)系。電場會對神經的導向生長（遷移）產生影響，而神經元的遷移還會受到其他多種因素的影響，其中體內的化學分子可以引導神經向不同方向遷移。如果電場對神經遷移的影響與體內化學分子對神經遷移的影響一致則可以從一定程度說明電場的刺激可能導致這些化學分子刺激神經發(fā)生神經導向生長。</p>

73、<p><b>　　研究目的</b></p><p>　　神經元和神經軸是神經系統(tǒng)的重要組成部分，但是神經元以及神經軸的損傷對神經系統(tǒng)正常功能的實現(xiàn)造成了很大的困難，所以怎樣實現(xiàn)損傷的神經元以及神經軸的恢復是一項非常重要的課題，神經功能的恢復在很大程度上依賴于神經軸的生長以及突觸的重新建立，有研究表明神經軸的生長以及突觸的重新建立依賴于神經導向生長過程。在眾多實現(xiàn)損傷神經恢復功能

74、的方法中，電刺激是近年來提出的比較可行的方法，但是電刺激對神經軸生長的機制并不清楚，神經軸生長以及突觸的建立是否與神經導向生長相關也沒有相關文獻支持。</p><p>　　本研究通過對皮層細胞進行電場加載并檢測神經突起的延伸變化以及神經導向受體DCC的分子基因表達，以此分析電場刺激對神經軸突遷移的影響，為神經損傷修復在理論和方法上提供實驗依據(jù)。</p><p><b>　　論文構

75、成及研究內容</b></p><p>　　本文分為 4個章節(jié)，除了第一章的緒論外，第二章介紹了實驗材料和實驗方法，對原代皮層神經細胞的體外培養(yǎng)提出了切實可行的操作流程，對于神經細胞加載電場對其進行電刺激觀察細胞形態(tài)以及基因表達情況詳細敘述了實驗的設計過程、實驗步驟以及實驗中發(fā)現(xiàn)的問題。第三章是實驗結果分析，在這一章中，給出了成功培養(yǎng)原代神經細胞的實驗圖、列出了部分成功的實驗數(shù)據(jù)，并且講述了實驗數(shù)據(jù)的處

76、理方法，針對每項實驗設計處理均分析了結果。最后一章是結論和展望，對神經細胞體外原代培養(yǎng)的方法給予了肯定，綜合第二章和第三章對實驗結果進行了總結并針對本實驗的結果提出了今后實驗發(fā)展的方向。</p><p>　　本課題研究內容主要包括： 1、大鼠皮層神經細胞的原代培養(yǎng)：采用原代培養(yǎng)技術，對出生當天的新生SD大鼠乳鼠進行大腦皮層神經細胞的分離培養(yǎng)和鑒定。2、電場加載實驗：采用電場刺激儀，利用鉑電極對培養(yǎng)的細胞進行電刺激

77、，分別檢測0mv, 50mv，100mv作用2h、4h后，觀察細胞的形態(tài)變化。刺激后的細胞，進行多聚甲醛固定后，采用免疫熒光技術，檢測β-tublin III，觀察神經突起的延伸變化。3、RT-PCR檢測DCC分子：對刺激后的細胞進行Trizol裂解后再RNA提取，對DCC分子基因進行RT-PCR擴增，檢測其基因表達水平。</p><p><b>　　實驗材料和方法</b></p>

78、;<p><b>　　實驗材料與設備</b></p><p><b>　　實驗藥品</b></p><p>　　DMEM高糖培養(yǎng)基（DMEM，碳酸氫鈉，HEPES，硫酸鏈霉素，青霉素），0.25%胰酶-EDTA消化液，胎牛血清，4%多聚賴氨酸包被液，4%多聚甲醛固定液，PBS洗液，阿糖胞苷溶液，一抗（兔抗tubulin-Ⅲ單克隆抗體

79、），二抗（驢抗兔Cy2），DAPI 染液。雙蒸水， 75%乙醇溶液，快速制冷劑。</p><p><b>　　實驗器材</b></p><p>　　二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-15AC，SANYO）、超凈工作臺（JJ-CJ-ZP潔凈工作臺，吳江市凈化設備總廠）、臺式離心機（TDL-40B，飛鴿牌）、熒光顯微鏡（Olympus MT-2;Nikon）、Rocking sha

80、ker （TS-92，QILINBEIER）、恒溫磁力攪拌器（81-2型，上海司樂儀器廠）、電子分析天平（AL104，Mettler Toledo）、照相體視顯微鏡（XTL-Ⅱ型，北京電子光學設備廠）、microplate reader（Model 680，BIO-RAD）、酸度計（PH510，Cyberscan）、立式自動電熱壓力蒸氣滅菌器（LDZX-40BI，上海申安醫(yī)療器械廠）、冰箱（BCD-278A/C，Haier）、烘箱（天津

81、市中環(huán)實驗電爐公司）、培養(yǎng)板（24孔，96孔）、培養(yǎng)皿（35 mm）、燒杯（1000 ml）、移液器、槍頭、酒精燈、眼科剪、鑷子、手術器械、離心管、量筒、洗瓶、廢液缸、載玻片、蓋玻片。</p><p><b>　　實驗動物</b></p><p>　　SD大鼠乳鼠（出生12h以內），由北醫(yī)動物中心提供</p><p>　　大鼠皮層神經細胞原代培

82、養(yǎng)</p><p>　　采用原代培養(yǎng)技術，對出生當天的新生SD大鼠乳鼠進行大腦皮層神經細胞的分離培養(yǎng)和鑒定。主要流程如下：</p><p><b>　　手術器械的高壓消毒</b></p><p>　　將分離取腦過程中所需手術器械（鑷子，手術剪，眼科剪，勺子，），10 cm玻璃培養(yǎng)皿，細胞過濾器，紗布，15 ml離心管，50 ml離心管，各種型號

83、槍頭用雙蒸水洗凈后，用報紙包嚴，置于高壓蒸汽滅菌鍋中120攝氏度，20min高壓滅菌消毒，培養(yǎng)皿需用酒精浸泡并且同時進行紫外光照射至少三個小時以徹底消毒。</p><p>　　DMEM高糖培養(yǎng)基過濾滅菌</p><p>　　用電子分析天平稱取碳酸氫鈉2g，HEPES 2g，硫酸鏈霉素粉末0.1g，青霉素粉末0.1g，取Gibco公司高糖DMEM培養(yǎng)基一袋加雙蒸水至1L后用恒溫磁力攪拌器攪拌

84、至固體物質完全溶解，調節(jié)PH至7.4。</p><p>　　于超凈間內用0.2 μm過濾器過濾已配置好的培養(yǎng)基。</p><p><b>　　細胞培養(yǎng)流程</b></p><p>　?。?）4%多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿過夜（3h以上）</p><p>　　（2）吸盡培養(yǎng)板內多聚賴氨酸，等待晾干后接種細胞</p&

85、gt;<p>　?。?）取兩個小培養(yǎng)皿，置于制冷劑上，各加入無血清的DMEM培養(yǎng)基2-3 ml</p><p>　?。?）用75%酒精消毒乳鼠后，于超凈臺內取其腦置于其中一個小培養(yǎng)皿中</p><p>　?。?）取大鼠乳鼠腦組織前額葉并置于另一小培養(yǎng)皿中</p><p>　　（6）用鑷子輕輕剝離已取好的腦組織外的腦膜，吸去原有培養(yǎng)基后剪碎腦組織，為消化

86、做準備</p><p>　?。?）加入3 ml含有1：1的0.02%EDTA：0.25%胰酶的消化液于已剪碎的腦組織中，用封口條密閉小培養(yǎng)皿并置于37℃恒溫箱中20-25 min，并且每五分鐘晃動培養(yǎng)皿促進消化過程的進行。</p><p>　?。?）取出小培養(yǎng)皿，于超凈臺內開蓋，加入3ml已含20%血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，即刻將其移入15 ml離心管內，繼續(xù)加入培養(yǎng)基并吹打終止消化（

87、注意防止氣泡的產生且動作盡量輕柔，防止細胞損傷嚴重）</p><p>　?。?）用0.2 nm的濾膜過濾所得細胞懸浮液后以1500 rpm離心5 min</p><p>　?。?0）吸出離心管上層培養(yǎng)基后加入1ml新培養(yǎng)基并吹打使沉淀的細胞團分散，繼續(xù)加入培養(yǎng)基稀釋細胞至接種密度約108</p><p>　?。?1）將細胞接種入已經鋪被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板，并用蒸餾

88、水加滿四周未接種細胞的空孔（主要用于減緩培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中的蒸發(fā)）</p><p>　?。?2）將接種好細胞的培養(yǎng)板置于5% CO2，37℃恒溫箱中培養(yǎng)，約2小時后在培養(yǎng)板中加入含20%血清的DMEM</p><p>　?。?3）第三天加入阿糖胞苷（終濃度為10 μM）</p><p>　?。?4）根據(jù)培養(yǎng)基的情況，不定期換液（含10%血清的DMEM）。</p&

89、gt;<p><b>　　電場加載實驗</b></p><p>　　采用電場刺激儀，利用鉑電極對培養(yǎng)的細胞進行電刺激，分別以電壓0mv, 50mv，100mv作用2h、4h后觀察細胞的形態(tài)變化。</p><p>　?。?）原代培養(yǎng)的神經細胞在培養(yǎng)第七天即上裝置進行電刺激實驗</p><p>　　（2）將電刺激實驗中所需要用到的鑷子

90、、鉑電極放入鋁盒中，高壓滅菌121℃20分鐘</p><p>　?。?）準備滅菌的鋁盒（鑷子、電極）、膠布、剪刀，超凈臺紫外光照射30分鐘</p><p>　?。?）將鉑電極如圖放置在細胞培養(yǎng)槽中，連上電極對其進行電刺激實驗</p><p><b>　　免疫熒光染色</b></p><p>　　對刺激后的細胞進行多聚甲醛

91、固定后，采用免疫熒光技術，檢測βtublin-III，觀察神經突起的延伸變化。</p><p><b>　　準備細胞</b></p><p>　　按皮層神經元的培養(yǎng)流程，將2ml的神經細胞懸浮液接種于內置4片小玻片的35 mm平皿上（玻片及平皿在接種神經元之前均需用4%多聚賴氨酸包被過夜），置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。在神經元培養(yǎng)的第三天，向小平皿中直接加入阿糖胞苷溶液2

92、0 μl（保證其終濃度為10 μM），繼續(xù)置于37攝氏度恒溫箱中培養(yǎng)。第七天做免疫熒光染色。</p><p><b>　　染色流程</b></p><p>　?。?）在培養(yǎng)的第七天，取出小平皿的內置小玻片，移入24孔板內（每孔一個小玻片），長有神經元的一面朝上</p><p>　?。?）每孔加入300 μlPBS溶液，輕輕振蕩后吸去所加入的PB

93、S溶液，重復三次，洗去小玻片上原有培養(yǎng)基</p><p>　?。?）每孔加入4%多聚甲醛300 μl，固定細胞15 min</p><p>　?。?）洗去甲醛溶液，同步驟2，PBS洗三次，洗去殘留的甲醛溶液</p><p>　?。?）加入200 μl 10%血清（需與二抗同源，本實驗中為驢血清）封閉非特異性位點</p><p>　?。?）吸去

94、血清溶液，PBS漂洗3次后，每孔加入200 μl一抗（兔抗tubulin-Ⅲ單克隆抗體）（用加有3%Tritons的PBS溶液稀釋一抗，本實驗中所用的稀釋比例為1：1000）后，室溫靜置2h或置于4℃冰箱過夜</p><p>　　（7）吸去一抗溶液，并用PBS洗三次（每次均需將24孔培養(yǎng)板置于搖床上振蕩3-5min）</p><p>　　（8）每孔加入200 μl二抗（驢抗兔cy2）溶液（

95、直接用PBS稀釋即可，本實驗所用稀釋比例為1：500），避光保存1-2 h</p><p>　?。?）吸去二抗溶液，并用PBS洗三次（每次均需將24孔培養(yǎng)板置于搖床上振蕩3-5min）</p><p>　　（10）往各小玻片上直接滴加10 μl的DAPI溶液染核幾分鐘</p><p>　?。?1）取一載玻片，于其上滴一滴加有甘油的PBS溶液（甘油與PBS一比一混合）

96、，將24孔板內小玻片取出，長有細胞的一面朝下扣在混合溶液上</p><p>　　（12）將已制好的標本置于熒光鏡下觀察</p><p>　　FDA（Fluorescein diacetate 乙酰熒光素）染色</p><p><b>　　配制染色所需的試劑</b></p><p>　?。?）如表2.1配制FDA溶液（5m

97、g/ml）</p><p>　　表2.1 FDA溶液配制</p><p>　　溶解了的FDA溶液置于-20℃保存</p><p>　　（2）如表2.2配制HBSS（1L）溶液</p><p>　　表2.2 HBSS溶液配制</p><p>　　配制好HBSS溶液后需進行除菌過濾操作，用濾器對配制好的溶液進行過濾<

98、/p><p><b>　　染色步驟</b></p><p>　?。?）20ul的5mg/ml FDA加入10ml HBSS溶液稀釋</p><p>　?。?）將配制好的溶液滴入細胞樣品中</p><p>　　（3）3-5min后將樣品在熒光顯微鏡下觀察</p><p>　　RT-PCR檢測DCC分子&

99、lt;/p><p>　　對刺激后的細胞進行Trizol裂解后再RNA提取，對DCC分子基因進行RT-PCR擴增，檢測其基因表達水平。</p><p>　　RT-PCR是將RNA的逆轉錄（RT）和cDNA的聚合酶的鏈式擴增（PCR）反應相結合的技術。這個過程首先要經過逆轉錄酶的作用將RNA逆轉錄合成 cDNA，以獲取cDNA片段，再以cDNA為模板以此復制合成目的片段。RT-PCR技術的用途非常

100、廣泛，它可以用于直接克隆特定基因的cDNA片段、也可以用于檢測細胞中RNA的含量和細胞中基因表達的水平。作為模板的RNA可以是細胞中的總RNA或者是mRNA，甚至可以是體外轉錄的RNA。無論使用的RNA是哪種類型，關鍵是要確保使用的RNA中沒有RNA酶和基因組 DNA的污染，所以需要在過程中除去RNA酶和DNA。本實驗采用皮層神經細胞的總RNA作為模板進行RT-PCR實驗。</p><p><b>　　

101、總RNA的提取</b></p><p>　?。?）用500ul Trizol處理細胞，充分裂解，將裂解液移至EP管中；</p><p>　?。?）加入100uL氯仿（三氯甲烷），劇烈震蕩15s，室溫放置5min；</p><p>　?。?）4℃，12000rpm，離心15min，取上層水相，置于另一個1.5ml EP管中；</p><

102、p>　　（4）加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置10min；</p><p>　　（5）4℃，12000rpm，離心15min，棄上清，加入冰浴預冷的75%乙醇500μl（DEPC水配制）清洗；</p><p>　?。?）4℃，12000rpm，離心5min，棄上清，自然風干8-10min；</p><p>　?。?）加入20μl DEPC水溶解沉淀，

103、用紫外分光光度計測定RNA濃度，用A260/A280吸光度比值判斷RNA純度。</p><p>　　注意事項：防止RNA酶污染的措施:</p><p>　?。?）所有使用的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長時間。塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡，有機玻璃的電泳槽可先用酸洗液和去污劑進行洗滌，并用雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 中10min，然后用0.1%

104、 DEPC水沖洗并晾干之。</p><p>　?。?）所有體系中的溶質應盡可能在37℃用0.1% DEPC處理12hr以上，然后再用121℃高壓滅菌20min除去殘留的DEPC水。不能用高壓高溫滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.2μm濾膜過濾除菌。</p><p>　?。?0）實驗過程中需要佩戴一次性口罩以防止唾液中的RNA酶對RNA的作用，也要戴手套并且實驗過程

105、中手套要勤換。所有的器械等應設置為RNA專用，這樣才能從更大程度上降低RNA酶等其他物質的污染。</p><p><b>　　反轉錄合成cDNA</b></p><p><b>　?。?）RT-1:</b></p><p>　　如表2.3配制反轉錄體系</p><p>　　表2.3 反轉錄體系1&l

106、t;/p><p>　　用DEPC水補至總體積為 15.25μl</p><p>　　低速離心混勻，使液體集中于EP管底部。置于PCR儀中，設置程序：72℃，5min；4℃，5min；</p><p><b>　?。?）RT-2：</b></p><p>　　配制反轉錄體系，每份樣品按表2.4加樣：</p>&l

107、t;p>　　表2.4 反轉錄體系2</p><p>　　低速離心混勻，使液體集中于EP管底部。置于PCR儀中，設置程序：58℃，60min；94℃，5min；</p><p>　　每管加入30μl滅菌蒸餾水，混勻，分裝成兩份，分別保存于4℃和-20℃。</p><p>　　RT-PCR注意事項:DEPC處理</p><p>　　DEPC

108、水：100ml超純水加入0.2ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。</p><p>　　Tip頭(槍頭）、EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip頭、EP管和PCR反應管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超純水加入1ml DEPC）37℃浸泡過夜，高壓滅菌。</p><p><b>　　PCR反應</b>&

109、lt;/p><p>　　表2.5 GAPDH和DCC的PCR引物</p><p>　　如表2.6配制20μl的PCR反應體系：</p><p>　　表2.6 PCR體系</p><p>　　用滅菌蒸餾水補足至20μl；</p><p>　　低速離心混勻，使液體集中于EP管底部；置于PCR儀中，設置程序：94℃，5min（預