VPA對神經(jīng)細(xì)胞損傷保護的分子機制研究.pdf

1、目的：①研究丙戊酸(valproicacid，VPA)對體外培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷的作用。②研究VPA預(yù)干預(yù)對永久性MCAO大鼠模型腦神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧損傷的作用。③探討VPA對神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺血損傷的作用機制。 方法：①利用無血清神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞和海馬神經(jīng)細(xì)胞，按0.1mM、0.5mM、1.0mM和20mM的濃度加入VPA后進行缺氧復(fù)氧處理，觀察VPA處理對神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷后的細(xì)胞生長和突起生

2、長的影響，光學(xué)顯微鏡下觀察，記數(shù)活細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)采用t檢驗或單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，比較結(jié)果。②SD大鼠分為對照組、VPA小劑量組、VPA中劑量組、VPA大劑量組和VPA超大劑量組，分別以0mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg劑量的VPA灌胃給藥，第七天參照Longa法建立永久性MCAO大鼠腦梗死模型，術(shù)后清醒時、24小時、48小時和72小時分別進行神經(jīng)功能缺損評分，最后一次評分后處死大鼠，

3、采血測血藥濃度，將每個大鼠腦切成腦片，利用圖形軟件計算腦梗死體積，結(jié)果進行t檢驗或單因素方差分析，確定VPA預(yù)干預(yù)在缺血性腦損傷中的保護作用。利用免疫組化技術(shù)，觀察VPA預(yù)處理后腦組織pERK1/2、caspase-3、HSP70和BrdU的表達(dá)，陽性細(xì)胞計數(shù)后經(jīng)t檢驗與對照組進行比較，對其作用機制進行初步的探討。 結(jié)果：①在VPA對皮質(zhì)細(xì)胞缺氧損傷中，大劑量組細(xì)胞存活明顯好于缺氧對照組(P＜0.001)，超大劑量組細(xì)胞存活明顯

4、差于缺氧對照組(P＜0.000)。在VPA對海馬細(xì)胞缺氧損傷組中，中劑量組和大劑量組細(xì)胞存活明顯好于缺氧對照組(P＜0.041；P＜0.08)，而超大劑量組細(xì)胞存活明顯差于缺氧對照組(P＜0.015)。②VPA中劑量組和大劑量組突起生長長度明顯長于缺氧對照組(P＜0.050H和P＜0.022)。對海馬神經(jīng)元也得到了相似的結(jié)果。③缺氧復(fù)氧后細(xì)胞和缺氧復(fù)氧后再培養(yǎng)5天的細(xì)胞均呈Bcl-2陽性，缺氧對照組呈弱陽性，而VPA處理各組均呈強陽性。

5、④神經(jīng)功能評分結(jié)果，在48小時時間點，小劑量組和中劑量組好于對照組(P＜0.05)；在72小時時間點，小劑量組好于對照組相(P＜0.05)⑤四組的腦梗死平均體積之間均有差異，對照組大鼠腦梗死的平均體積最大，與對照組相比較，VPA各處理組平均腦梗死體積均縮小。與對照組比較，中劑量組和大劑量組具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05；P＜0.05)，而小劑量組沒達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性標(biāo)準(zhǔn)(P＞0.05)。⑥皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞計數(shù)顯示VPA處理組神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)目顯著

6、多余對照組(P＜0.05)⑦pERK1/2表達(dá)在缺血側(cè)大腦頂葉皮質(zhì)層細(xì)胞和紋狀體外側(cè)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，VPA組明顯強于對照組，海馬處未見陽性細(xì)胞。⑧與照組強相比，VPA處理組caspase-3表達(dá)明顯減弱，表明VPA能夠減少缺血誘導(dǎo)的caspase-3的表達(dá)(P＜0.001)。⑨缺血72小時后VPA組在缺血側(cè)的大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體均有HSP70表達(dá)；缺血對照組在皮質(zhì)和海馬弱表達(dá)，壞死紋狀體區(qū)域幾乎沒有陽性表達(dá)。細(xì)胞計數(shù)顯示VPA組皮質(zhì)和海

7、馬HSP70表達(dá)與對照組比較具有顯著差異(P＜0.001)。⑩在海馬CA1區(qū)可見陽性BrdU細(xì)胞，與對照組比較，VPA處理組病側(cè)海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞明顯增多(P＜0.001)，提示PVA對MCAO大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞具有誘導(dǎo)增殖作用。 結(jié)論：①VPA對離體和在體神經(jīng)細(xì)胞缺血、缺氧性損傷具有肯定的神經(jīng)保護作用，并且此神經(jīng)保護作用與其劑量大小有一定關(guān)系。 ②VPA神經(jīng)保護機制涉及HSP70表達(dá)的提高和caspase-3表達(dá)的抑