紅花黃色素A的提取分離及其對神經(jīng)細胞損傷保護作用研究.pdf

1、紅花，為菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L.）的干燥管狀花，是一種傳統(tǒng)的中草藥?，F(xiàn)代藥理研究表明紅花中水溶性的紅花黃色素是紅花的主要有效成分，呈現(xiàn)出多種藥理活性，紅花黃色素是含有多種成分的混合物，紅花黃色素A（Saffloweryellow A，SYA）是重要的活性成分之一。
　　本文以紅花為原料，采用水滲漉和多步柱層析法分離純化獲得紅花黃色素A（SYA）并確證了結(jié)構(gòu)；體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細胞瘤株（SH-SY5

2、Y）和原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細胞，分別采用谷氨酸（Glutamic acid，Glu）進行外源性損傷，探究紅花黃色素A對谷氨酸損傷的SH-SY5Y細胞和大鼠海馬神經(jīng)元細胞的保護作用并從分子水平驗證其保護機制。為開發(fā)具有神經(jīng)細胞保護、拮抗損傷凋亡作用的新藥，提供了豐富的理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　（1）紅花藥材去離子水滲漉，濃縮滲漉液，醇沉除雜，濃縮液經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂柱層析得到紅花黃色素A粗品，再經(jīng)過葡聚糖凝膠（

3、Sephadex LH-20）柱層析得到紅花黃色素A純品。
　　（2）新生大鼠海馬神經(jīng)元細胞原代培養(yǎng)方法的建立，采用無血清培養(yǎng)方法，兩天半量換液并采用甲苯胺藍染色法對海馬神經(jīng)元進行鑒定。根據(jù)文獻確定了SH-SY5Y細胞培養(yǎng)方法。
　　（3）采用谷氨酸建立細胞損傷模型，MTT比色法測定細胞活力并確定谷氨酸最佳造模濃度，最終確定SH-SY5Y以2mM的谷氨酸終濃度損傷24h，在實驗條件下細胞的損傷率為30％；大鼠海馬神經(jīng)元細胞以

4、100uM的谷氨酸濃度損傷24h。
　?。?）倒置相差顯微鏡下觀察可見，正常狀態(tài)下的SH-SY5Y細胞呈梭形或三角形，有明顯突觸，細胞飽滿，立體感強；使用濃度為2mM的Glu作用24h后，可見明顯損傷，鏡下可觀察到細胞的突起消失，腫脹圓縮，立體感差，折光性下降，貼壁能力下降，細胞聚集，部分細胞裂解成碎片；紅花黃色素A給藥組與模型組相比，低濃度SYA（5μg/mL）可以減輕谷氨酸對SH-SY5Y細胞的損傷；高濃度SYA（10μg/m

5、L）能明顯減輕 Glu對 SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響，表現(xiàn)為細胞折光性較好，細胞碎片形成減少，細胞聚集減少。
　　原代培養(yǎng)48h的神經(jīng)元細胞可見細胞分散均勻，胞體呈三角形或多邊形，飽滿立體感強，部分細胞伸出較短的突觸；培養(yǎng)至第七天的神經(jīng)元細胞樹突軸突明顯并連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；100μM濃度的Glu作用24h后，可觀察到細胞明顯損傷，大部分細胞皺縮，突起消失，胞體立體感差，可見較多凋亡細胞；紅花黃色素A保護組細胞生長狀態(tài)良好，細胞間仍保

6、持良好的突起聯(lián)系，較少出現(xiàn)細胞皺縮的現(xiàn)象。
　?。?）MTT比色法結(jié)果顯示，紅花黃色素A預(yù)處理兩小時，共孵育24h，與模型組相比，紅花黃色素A兩個濃度組對谷氨酸損傷均呈現(xiàn)出一定的保護作用；細胞形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，紅花黃色素A給藥組的細胞損傷程度較弱。
　?。?）免疫熒光組化分析不同實驗組細胞內(nèi)Bcl-2，Bax蛋白的表達，Westem-blot法檢測不同實驗組細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2與 Bax的表達水平及活性部分Caspa

7、se-3及Caspase-9含量變化。結(jié)果表明與正常組相比Glu損傷組細胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2表達水平明顯降低而紅花黃色素A（10μg/mL）給藥組能夠維持較高的Bcl-2表達水平。與正常組相比Glu損傷組細胞中促凋亡蛋白Bax表達水平明顯升高，紅花黃色素A（10μg/mL）給藥組能夠在一定程度上抑制Bax的表達。Glu能夠誘導(dǎo)活性Caspase-9和Caspase-3含量顯著升高而紅花黃色素A能夠通過抑制Caspase-9和Cas