紅花黃色素對(duì)雞趾屈肌腱損傷修復(fù)影響的實(shí)驗(yàn)證實(shí).pdf

1、目的：
　　 肌腱損傷是手外科學(xué)多發(fā)性外傷，肌腱修復(fù)術(shù)后常常形成限制性粘連，嚴(yán)重影響手部功能的恢復(fù)，迄今為止尚無(wú)一種完全行之有效的防治措施。病理學(xué)研究顯示肌腱及其周圍相關(guān)組織均參與此損傷修復(fù)過(guò)程；即所謂內(nèi)源性愈合和外源性愈合。本實(shí)驗(yàn)研究借助Leghorn雞屈趾肌腱損傷修復(fù)模型、體視學(xué)觀察、生物力學(xué)檢測(cè)、病灶區(qū)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(BFGF)，和Ⅰ型膠原蛋白免疫組化探察等方法，研究證實(shí)肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中局部病理學(xué)變化及其變化規(guī)律

2、；局部炎癥反應(yīng)、BFGF和Ⅰ型膠原蛋白對(duì)肌腱損傷修復(fù)的影響；紅花黃色素在病灶區(qū)炎癥反應(yīng)、BFGF和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)以及肌腱愈合過(guò)程中的作用。以此探討紅花黃色素在肌腱損傷后修復(fù)過(guò)程中的臨床作用及其作用機(jī)制。
　　 方法和材料：
　　 1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象：
　　 選用同批孵出、在相同自然條件下喂養(yǎng)的3月齡的健康雄性白色Leghorn雞56只，體重1.1～1.3kg(平均1.23±0.068kg)。假手術(shù)組雙側(cè)雞爪第3趾切

3、開(kāi)皮膚后逐層進(jìn)入暴露趾深屈肌腱，但不對(duì)肌腱做任何處理，然后逐層縫合。實(shí)驗(yàn)組所有Leghorn雞制備雙側(cè)雞爪第3趾趾深屈肌腱橫斷后修復(fù)模型，方法和標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)[2]。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法
　　 (1)模型構(gòu)建：對(duì)雙側(cè)雞爪第3趾趾深屈肌腱手術(shù)橫斷，之后再行外科縫合，術(shù)后使用石膏固定使其呈拳擊手套狀，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨后回籠飼養(yǎng)，并使其能夠自由活動(dòng)。術(shù)后3天以含土霉素雞飼料喂養(yǎng)，旨在預(yù)防感染。
　　 (2)體視學(xué)和組織病理學(xué)檢測(cè)：分

4、別于術(shù)后1、2、4、6周進(jìn)行取材，期間行體視學(xué)觀察；包括大體觀察雞趾深屈肌腱吻合口肉芽組織增生情況、肌腱愈合情況和肌腱周圍粘連的情況，并對(duì)肌腱與周圍組織粘連進(jìn)行評(píng)級(jí)，以評(píng)估其粘連程度，方法及標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)[3]。組織學(xué)探察；HE染色之后在光鏡下觀察肌腱細(xì)胞爬行、細(xì)胞形態(tài)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維生成及排列情況。
　　 (3)生物力學(xué)檢測(cè)：將不同修復(fù)時(shí)間組的樣本(肌腱)由近端至止點(diǎn)從腱鞘內(nèi)小心銳性游離出來(lái)，然后固定于生物力學(xué)檢測(cè)儀上進(jìn)行抗張

5、力測(cè)試，詳盡方法、技術(shù)和原理見(jiàn)[2]。
　　 (4)免疫組化檢測(cè)：本實(shí)驗(yàn)主要采用免疫組織化學(xué)PAP方法；即將Rabbit anti-chicken collagen-Ⅰ和Mouse anti-bFGF抗體在4℃孵育48～72小時(shí)；然后分別進(jìn)行抗兔和抗小鼠IgG(1∶100)室溫孵育2小時(shí)；最后分別進(jìn)行兔-PAP和小鼠-PAP(1∶200)室溫孵育2小時(shí)；DAB-H2O2顯色。
　　 (5)數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　

6、 肌腱粘連程度的評(píng)估按照湯錦波[2]論文粘連分度法，而且對(duì)于所得數(shù)據(jù)專門使用Mann Whitney U檢驗(yàn)(兩組)和H檢驗(yàn)(多組)。但組織化學(xué)(HE)和免疫組化染色的陽(yáng)性結(jié)構(gòu)則是借助于IPPS15.0圖像分析系統(tǒng)在光鏡高倍視野(×400)下獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示)，并對(duì)所獲得數(shù)據(jù)使用SPSS10.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，它們兩組間比較使用t檢驗(yàn)，以P＜0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多組間比較則使用

7、方差分析ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 (1)病灶區(qū)組織病理學(xué)變化
　　 觀察顯示正常組肌腱完整光滑、腱鞘內(nèi)可見(jiàn)淡黃色滑液、肌腱與腱周組織無(wú)粘連、肌腱滑動(dòng)性良好。在假手術(shù)組呈現(xiàn)輕度的粘連，但易分離，而且肌腱滑動(dòng)性能基本良好。
　　 實(shí)驗(yàn)組肉眼觀察顯示，在術(shù)后1周組病灶區(qū)肌腱愈合處及其周圍組織存在明顯的水腫、粘連、肉芽組織增生。上述變化在術(shù)后2周組雖然水腫稍有減輕，

8、但肉芽組織增生加重，周圍組織的粘連情況顯示其形成于術(shù)后1周，并于損傷2周時(shí)加重。術(shù)后4-6周，病灶區(qū)水腫減退、肉芽組織疤痕化、但粘連程度變化不明顯。對(duì)所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示損傷1周時(shí)間組肌腱粘連程度明顯低于2-6周時(shí)間組(P＜0.05)，但在損傷2-6時(shí)間組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)之間。組化染色(HE)顯示在吻合口處存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或聚集，其數(shù)量與損傷修復(fù)時(shí)間和病灶區(qū)病理學(xué)變化基本一致；即在損傷1-2周時(shí)間組，炎性細(xì)

9、胞的數(shù)量最多，隨后其數(shù)量逐漸減少。
　　 (2)損傷肌腱修復(fù)的抗張力強(qiáng)度變化及其規(guī)律
　　 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以生物力學(xué)原理檢測(cè)損傷肌腱修復(fù)過(guò)程中的抗張力強(qiáng)度變化。所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間抗張力強(qiáng)度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。但不同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組之間的抗張力強(qiáng)度從術(shù)后1-6周，顯示逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，術(shù)后6周抗張力強(qiáng)度達(dá)到最高，與其它實(shí)驗(yàn)組相比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，但仍未恢復(fù)到正常水平，與正常之間仍有統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 (3)肌腱細(xì)胞在肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化
　　 肌腱細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞和腱細(xì)胞兩類，兩者在不同病理和機(jī)能狀態(tài)顯示不同的形態(tài)，并相互轉(zhuǎn)換。正常肌腱組織的組織化學(xué)(HE)染色顯示成纖維細(xì)胞核呈梭形，細(xì)胞呈纖維狀排列整齊，密度適中。而腱細(xì)胞核染色較深呈圓塊狀，胞體為不規(guī)則形或卵圓形。在肌腱損傷的各實(shí)驗(yàn)組，兩者在組化染色中難以區(qū)分。所以，在此文我們統(tǒng)稱為肌腱細(xì)胞。
　　 光鏡觀察顯示

11、肌腱細(xì)胞在病灶區(qū)其核和胞質(zhì)染色加深、體積增大，表現(xiàn)為增生肥大樣外觀。肌腱細(xì)胞的計(jì)數(shù)資料顯示，肌腱細(xì)胞在損傷1周其數(shù)量開(kāi)始增加，到2周時(shí)達(dá)到高峰，之后逐漸下降，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示肌腱細(xì)胞數(shù)量的變化在各實(shí)驗(yàn)組之間比較具有顯著差異(P＜0.01)。與對(duì)照組比較結(jié)果顯示，在損傷1-4周實(shí)驗(yàn)組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但在損傷6周組肌腱細(xì)胞數(shù)量接近對(duì)照組(P＞0.05)。
　　 (4)病灶區(qū)BFGF和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的變化
　　

12、 BFGF在肌腱組織主要表達(dá)于損傷組織中的成纖維細(xì)胞、腱細(xì)胞和局部炎癥細(xì)胞。我們的免疫組織化學(xué)探察顯示，正常肌腱弱表達(dá)BFGF。在肌腱損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)組，光鏡觀察顯示陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)多形性外觀，定量資料顯示其數(shù)量與損傷修復(fù)時(shí)間具有相關(guān)性；在損傷1周時(shí)間組陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量開(kāi)始增加，并明顯多于對(duì)照組(P＜0.01)，持續(xù)到損傷修復(fù)6周，其數(shù)量仍然顯著多于對(duì)照組(P＜0.01)。對(duì)不同損傷修復(fù)時(shí)間組間比較結(jié)果顯示，在損傷2周時(shí)間組BFGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增

13、加最明顯(P＜0.01)。進(jìn)一步按照損傷肌腱不同區(qū)域的探察顯示，BFGF陽(yáng)性細(xì)胞在吻合口處的數(shù)量在各損傷修復(fù)時(shí)間組均多于遠(yuǎn)離區(qū)域(P＜0.01)。
　　 Ⅰ型膠原陽(yáng)性蛋白廣泛存在于肌腱組織的腱纖維和腱細(xì)胞之間的基質(zhì)內(nèi)。免疫組化探察結(jié)果顯示，在正常肌腱組織明顯可見(jiàn)陽(yáng)性結(jié)構(gòu)呈纖維狀位于腱纖維之間。定量資料顯示，在肌腱損傷各時(shí)間組的Ⅰ型膠原陽(yáng)性蛋白的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。對(duì)不同損傷修復(fù)時(shí)間組間比較結(jié)果顯示，Ⅰ型膠原陽(yáng)

14、性蛋白高表達(dá)于損傷之后1周，到第2周時(shí)其表達(dá)量達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，到達(dá)損傷修復(fù)6周時(shí)仍高于正常水平(P＜0.05)。
　　 (5)紅花黃色素治療對(duì)肌腱損傷修復(fù)的影響
　　 *對(duì)病灶區(qū)組織病理學(xué)變化的影響；通過(guò)大體觀察、組化染色結(jié)果顯示在不同的損傷修復(fù)時(shí)間組，紅花黃色素明顯抑制病灶區(qū)組織水腫、粘連程度、和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)或聚集(P＜0.05)。但紅花黃色素用藥組在各時(shí)間組中肌腱細(xì)胞的數(shù)量明顯多于非用藥組，兩者之間比較具有

15、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 *對(duì)肌腱抗張力強(qiáng)度的影響：生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示紅花黃色素用藥組在不同的損傷修復(fù)時(shí)間組與非用藥組之間比較，用藥組肌腱抗張力強(qiáng)度明顯高于非用藥組(P＜0.01)。
　　 *對(duì)病灶區(qū)BFGF和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響：細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示紅花黃色素用藥組BFGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目在損傷修復(fù)各時(shí)間組均明顯高于非用藥組(P＜0.01)。Ⅰ型膠原蛋白定量資料顯示紅花黃色素用藥組Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)量在各損傷

16、修復(fù)時(shí)間組均明顯高于非用藥組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中，局部病理變化顯示明顯的時(shí)間依賴性
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)病灶及其周圍區(qū)的炎癥細(xì)胞聚集、水腫和組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化均發(fā)生于肌腱損傷之后1周，到達(dá)2周時(shí)其反應(yīng)和變化達(dá)到高峰，隨著損傷修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，其反應(yīng)和變化逐漸減弱和下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)證實(shí)，病灶區(qū)組織的粘連程度則與肌腱損傷修復(fù)時(shí)間成正相關(guān)系；即隨著損傷修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，其粘連程度

17、逐漸加重。
　　 (2)BFGF和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)對(duì)損傷肌腱的修復(fù)具有促進(jìn)作用
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)病灶區(qū)的BFGF和Ⅰ型膠原蛋白的高表達(dá)變化均發(fā)生于肌腱損傷之后1周，到達(dá)2周時(shí)其反應(yīng)和變化達(dá)到高峰，與此同時(shí)病灶及其周圍區(qū)的炎癥細(xì)胞聚集、水腫和組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化最為嚴(yán)重。在BFGF和Ⅰ型膠原蛋白隨著損傷修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱和下降的同時(shí)，病灶區(qū)組織病理學(xué)變化則逐漸減輕，而損傷肌腱的抗張力強(qiáng)度則逐漸增強(qiáng)。提示病灶區(qū)BFGF和

18、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)密切牽涉到損傷肌腱的修復(fù)過(guò)程，對(duì)其修復(fù)具有促進(jìn)作用。
　　 (3)紅花黃色素促進(jìn)BFGF和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)及其損傷肌腱的修復(fù)過(guò)程
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)病灶區(qū)組織病理學(xué)變化、BFGF和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)、損傷肌腱的抗張力強(qiáng)度變化均隨損傷修復(fù)時(shí)間而不同。但各不同時(shí)間組，紅花黃色素用藥組與非用藥組之間上述變化均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，特別是紅花黃色素明顯促進(jìn)損傷肌腱BFGF和Ⅰ型膠原蛋白的高表達(dá)，與此同時(shí)病灶區(qū)組織病