紅花黃色素對控制性低血壓誘導(dǎo)的缺血缺氧性腦損傷的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　基于筆者前期研究的關(guān)于控制性降壓不同水平對海馬CA1區(qū)的影響結(jié)果，發(fā)現(xiàn)將MAP降至基礎(chǔ)值的45％時，兔海馬CA1神經(jīng)元凋亡程度最嚴(yán)重，而SYP對兔較低CH水平誘導(dǎo)的缺血缺氧性腦損傷的影響及作用機制，目前少見報道。因此，本研究通過建立硝普鈉單純性控制性低血壓動物模型，觀察紅花黃色素對缺血缺氧性腦損傷后線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷程度以及缺血損傷相關(guān)蛋白（Caspase-3、nNOS和HIF-1α）表達的影響，探討低血壓狀態(tài)下SY

2、P對兔腦海馬神經(jīng)元的保護作用以及可能的發(fā)生機制，為臨床研究提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.動物與分組:健康新西蘭白兔40只（雌雄各半，體重1.8～2.2Kg，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），隨機分為5組，每組8只。正常組（N組），控制性降壓組（即CH組，平均動脈壓[MAP]降至基礎(chǔ)值的45％組），SYP預(yù)處理組（SYP1組，控制性降壓基礎(chǔ)值45％前30min靜脈給予SYP，2ml/kg，用生理鹽水配制，含SYP1.6m

3、g/ml），SYP后處理組（SYP2組，控制性降壓基礎(chǔ)值45％開始后30min靜脈注射SYP，2ml/kg，用生理鹽水配制，含SYP1.6mg/ml），SYP預(yù)處理+后處理組（SYP1+SYP2組，控制性降壓基礎(chǔ)值45％開始前30min和開始后30min均給予靜脈注射SYP，2ml/kg，用生理鹽水配制，含SYP1.6mg/ml)。
　　2.模型制作:本研究沿用筆者前期的實驗方法對新西蘭大白兔進行控制性降壓模型的制作，具體操作步驟

4、如下:將禁飲禁食12h的實驗兔用水合氯醛腹腔注射麻醉后，在兔臺上固定頭與四肢。剃除頸前部兔毛，消毒，行氣管切開插氣管導(dǎo)管并接動物呼吸機機械通氣（潮氣量21ml，呼吸51 bpm，F(xiàn)iO21.0）。分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈、穿刺置管，接延長管輸液通路并輸液。左側(cè)腹股溝四周剪毛，消毒，于腹股溝下緣靠內(nèi)測分離股動脈并穿刺置管，接測壓轉(zhuǎn)換器通路行平均動脈測壓。操作結(jié)束，無菌濕紗布覆蓋傷口，輸注適量乳酸鈉林格氏液，補充禁食喪失的液體總量約15ml/kg;

5、將兔臺平放于39.5℃恒溫毯上保溫。待血壓穩(wěn)定15min后，記錄此刻基礎(chǔ)的平均動脈壓(MAP)、心率(HR)、中心靜脈壓(CVP)。正常組采用5％葡萄糖注射液4ml/(kg.h)連續(xù)泵注;降壓組及治療組均采用5％葡萄糖液配制的硝普鈉(400ug/ml)開始泵注，10～15分鐘內(nèi)降至目標(biāo)血壓，通過間斷的調(diào)節(jié)泵速，維持目標(biāo)血壓1h。根據(jù)上述分組方案，在對應(yīng)的時間給予紅花黃色素。降壓期間所有動物的補液量（包括降壓藥物液體量），依據(jù)CVP調(diào)整，

6、盡量減少補液量對血容量的影響。降壓完畢后，各實驗動物用乳酸鈉林格氏液4ml/(kg·h)泵速再灌注2h后處死。取實驗動物海馬CA1區(qū)神經(jīng)元組織行病理學(xué)檢查，采用透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)改變，TUNEL法染色觀察腦組織標(biāo)本的細胞凋亡情況，使用免疫組化及Western blot檢測海馬組織中nNOS、HIF-1α、以及Caspase-3蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.所有動物模型均制作成功，未出現(xiàn)因麻醉或手術(shù)意外的死亡。正常

7、組死亡率為0，CH組死亡6只:2只死于降壓45min后，其余4只死于復(fù)壓開始后，死亡率75％; SYP1、SYP2、SYP1+SYP2組的動物分別死亡1只、2只、1只，均陸續(xù)死于復(fù)壓1h后，其死亡率均低于CH組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2.透射電鏡下觀察海馬CA1區(qū)線粒體超微結(jié)構(gòu)及Flameng評分:N組細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞器清晰可見，核仁染色質(zhì)均勻，未見核固縮碎裂或溶解;CH組可見超微結(jié)構(gòu)損傷較嚴(yán)重，可見核碎裂、溶解，

8、細胞器結(jié)構(gòu)基本被破壞;SYP1組、SYP2組、SYP1+SYP2組損傷較CH組有所減輕，未見明顯的核碎裂及溶解，細胞間連接緊密;CH組線粒體Flameng評分較其他組均高(P＜0.05)，其余各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.TUNEL染色觀察凋亡細胞、計算凋亡指數(shù):N組細胞結(jié)構(gòu)正常，可見極少量TUNEL陽性染色細胞;CH組陽性細胞數(shù)目顯著增多;紅花黃色素處理組（SYP1組、SYP2組、SYP1+SYP2組）T

9、UNEL陽性染色細胞較CH組顯著減少(P＜0.05);但SYP2組凋亡細胞數(shù)較其他兩組（SYP1組、SYP1+SYP2組）多，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.免疫組化和Western blot檢測海馬CA1區(qū)nNOS、HIF-1α、Caspase-3蛋白的表達:與N組相比，CH組nNOS、HIF-1α、Caspase-3表達顯著增加;紅花黃色素處理組（SYP1組、SYP2組、SYP1+SYP2組）較CH組表達下降，SY

10、P2組與其他兩組比較各蛋白含量有所增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.通過形態(tài)學(xué)等研究證實紅花黃色素對控制性低血壓誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷具有保護作用，在一定程度上可能降低其死亡率;
　　2.在腦缺血再灌注損傷中，紅花黃色素起到保護作用可能與減少nNOS和HIF-1α的含量有關(guān);
　　3.紅花黃色素通過抑制Caspase-3蛋白的表達，減少細胞的凋亡，從而抑制腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)元的凋亡