羥基紅花黃色素A對(duì)LPS誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性損傷的干預(yù)作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、奶牛子宮內(nèi)膜炎是引起奶牛發(fā)生不孕癥的最主要原因之一，可引起增加人工授精配種次數(shù)，延長(zhǎng)奶牛的受孕間隔，降低奶牛妊娠率和受孕率等重大問(wèn)題，往往給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。病原菌感染是引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要原因之一其中以大腸桿菌為主，大腸桿菌進(jìn)入機(jī)體后可釋放產(chǎn)生大量 LPS，引起奶牛子宮發(fā)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，引發(fā)子宮內(nèi)膜炎。常用的中藥紅花，常用于奶牛子宮內(nèi)膜炎治療，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛的作用，而羥基紅花黃色素A（HYSA）是中藥紅花的最主要水

2、溶性有效成分之一。因此，本研究為了探討HSYA對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性損傷的干預(yù)作用及其分子機(jī)制，開(kāi)展了以下研究：
　　1.通過(guò)膠原蛋白酶和胰蛋白酶消化法分離、培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，再采用差速消化法純化得到上皮細(xì)胞，免疫組化法鑒定了奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。成功建立了奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，為后續(xù)研究奠定了研究基礎(chǔ)。
　　2.通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞體外增殖的影響，結(jié)果表

3、明：1μg/mL LPS作用24h時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖作用最為明顯（P＜0.05），ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，1μg/mL LPS可誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞IL-1β和TNF-α分泌量顯著升高（P＜0.05），確定LPS的作用濃度為1μg/mL，作用時(shí)間是24h。
　　3.以1μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL的HSYA作用24h后，MTT法檢測(cè)HSYA對(duì)奶牛子宮上

4、皮細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明：HSYA對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖無(wú)明顯毒性，且促進(jìn)其增殖。因此，確定HSYA作用濃度分別為80μg/mL（高劑量組）、20μg/mL（中劑量組）、5μg/mL（低劑量組）。
　　4.分別用高、中、低劑量的HSYA作用奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞24hr后，采用real-time PCR法檢測(cè)上皮細(xì)胞中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA表達(dá)量。結(jié)果表明，LPS組奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TL

5、R4和細(xì)胞因子IL-1β、1L-6、IL-8、TNF-α、mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），經(jīng)5、20、80μg/mL的HSYA作用奶牛子宮內(nèi)上皮細(xì)胞24hr后，各組細(xì)胞TLR4和細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8和1L-6 mRNA表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明HSYA可通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TLR4和相關(guān)炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)起抗炎作用。
　　5.通過(guò)Western-blot檢測(cè)奶

6、牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中NF-κB、MAPKs信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白 p-IκBα/IκBα、p-p65/p65蛋白以及 P-JNK、p-pP38、p-ERK1/ERK2的表達(dá)變化，確定HYSA對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性損傷的細(xì)胞信號(hào)通路的作用，確定其分子調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明：LPS可刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的p-IκB/IκB和p-p65/p65相對(duì)比率均顯著升高（P＜0.05），同時(shí)還刺激p-JNK、p-ERK1/2、p-p38蛋白

7、表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），即LPS可通過(guò)誘導(dǎo)NF-?B和MAPK信號(hào)通路的激活，誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性損傷；而經(jīng)過(guò)高、中、低劑量的HSYA作用后，奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的p-IκB/IκB和p-p65/p65相對(duì)比率顯著降低（P＜0.05），與LPS組相比，除低劑量HSYA組上皮細(xì)胞的p38磷酸化水差異不顯著（P＞0.05）外，中、高劑量的HSYA處理后細(xì)胞的JNK、ERK1/2、P38磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）。